بخشی از مقاله
چکیده:
باکتري سودوموناس آئروژینوسا1 میکروارگانیسمی است که به فراوانی در خاك یافت میشود. یکی از محصولات تولیدي توسط این میکروارگانیسم در هنگام رشد بر روي گلوکز، گلیسرول و یا تريگلیسرید دو نوع بیوسورفکتانت مونورامنولیپید و ديرامنولیپید است. با توجه به کاربرد روزافزون این ماده تولید بهینه آن از اهمیت زیادي برخوردار است. براي تولید بهینهي این ماده باید پارامترهاي سینتیکی رشد این باکتري مشخص باشد.
در این کار پارامترهاي سینتیکی µmax، kS و kN براي باکتري سودوموناس آئروژینوسا با شمارهي شناسایی استاندارد پایگاه میکروبی آمریکا 53752 - ATCC - بر روي سوبستراي گلیسرول و منبع نیتروژن نیترات سدیم و هوادهی با استفاده از پمپ هوا تعیین شدهاند kS - و kN به ترتیب نشان دهندهي ثوابت نیمه اشباع براي منبع کربن و منبع نیتروژن بوده و µmax بیشترین سرعت رشد را نشان میدهد - . براي نزدیکتر شدن شرایط آزمایش به شرایط تولید صنعتی، از پمپ براي هوادهی استفاده شد. براي تعیین این پارامترها از روش اندازهگیري سرعت اولیه رشد استفاده شد که مقادیر به دست آمده آنها µmax = 0.6908 - hr -1 - ، kS = 0.0709 - g/L - و kN = 0.2450 - g/L - بود.
مقدمه:
بیوسورفکتانتها یا سورفکتانتهاي میکروبی بیومولکولهاي فعال سطحی هستند که توسط بسیاري از میکروارگانیسمها تولید میشوند - . - 3 این مواد دوسر بوده و هنگام قرار گرفتن در سطح مشترك دو مایع با قطبیت متفاوت توانایی اتصال به مولکولهاي هر دو مایع را دارند و در نتیجه کشش سطحی و بین سطحی در حضور بیوسورفکتانتها کاهش مییابد و امکان حلالیت آب در هیدروکربنها و برعکس ایجاد میشود - . - 8 بیوسورفکتانتها در حال حاضر در زمینههاي زیادي مانند افزایش برداشت نفت، تصفیه بیولوژیکی محیط، صنایع غذایی، صنایع دارویی و غیره کاربرد دارند.
کاربرد این مواد به دلیل خصوصیاتی مانند زیست تخریب پذیري بالا و مسمومیت پایین در حال افزایش است، با این وجود به دلیل بازده پایین تولید و هزینههاي بالاي جداسازي و خالصسازي، تولید انبوه آنها در حال حاضر مقرون به صرفه نیست - . - 3 رامنولیپیدها که یکی از انواع بیوسورفکتانتهايگلایکولیپید هستند عمدتاًتوسط باکتري سودوموناس آئروژینوسا تولید میشوند . در میان انواع بیوسوفکتانتهایی که تاکنون شناخته شدهاند، رامنولیپیدها موثرترین نوع هستند. علت این برتري را میتوان ناشی از خصوصیات ویژهاي مانند فعالیت زیاد در امولسیفیکاسیون و مقدار پایین غلظت بحرانی مایسل دانست - . - 4 براي تولید این ماده پرکاربرد در مقیاس صنعتی، اطلاع از پارامترهاي سینتیکی الزامی است. جهت به دست آوردن این پارامترها میتوان از تعیین سرعت رشد در ساعات اولیه تخمیر2 - فاز لگاریتمی - استفاده کرد.
مواد و روشها:
ترکیب محیط کشت و نوع میکروب استفاده شده:
محیط پایه معدنی مورد استفاده در تمامی آزمایشها یکسان بوده و از ترکیب دو محلول زیر تهیه شد؛ براي تهیه محیط کشت، 25 میلیلیتر از محلول 2 با 975 میلیلیتر از محلول 1 مخلوط شد.
3.4 g/L KH2PO4, 4.3 g/L K2HPO4 , 0.2 g/L MgSO4.7H2O, 0.04 g/L CaCl2.2H2O, 0.04 g/L FeSO4 1 - 0.068 g/L ZnSO4, 0.006 g/L CuSO4, 0.07 g/L NaMoO4, 0.015 g/L H3BO3, 0.4 g/L ZnCl2 2 - مقدار مورد استفاده از نیترات سدیم - CN - و گلیسرول - CS - با توجه به شماره آزمایش متفاوت بوده و در جدول 1 گزارش شده است. میکروارگانیسم مورد استفاده سویهاي از باکتري سودوموناس آئروژینوسا با شماره شناسایی استاندارد پایگاه میکروبی آمریکا53752 1 بود.
اجزاي سیستم و راکتور مورد استفاده:
راکتور مورد استفاده یک ظرف یک لیتري بود که هوادهی به آن با استفاده از یک پمپ هوا و با شدت جریان ثابت 1 لیتر بر دقیقه انجام شد. هواي ورودي به راکتور با استفاده از فیلترهاي پنبهاي استریل شد. دماي راکتورها با استفاده از قرار دادن آنها در یک حمام آب تنظیم و در 37 درجه سانتیگراد ثابت نگه داشته شد.
اندازهگیري مقدار بیومس و بیوسورفکتانت تولیدي:
براي کمیسازي بیومس تولیدي از روش جرم خشک استفاده شد - . - 5 مقدار رامنولیپید تولید شده با استفاده از روش فنول - سولفوریک اسید بر مبناي مقدار رامنوز موجود در محیط گزارش شده است. براي انجام این کار مقداري از محیط تخمیر سانتریفیوژ 6000 - دور بر دقیقه، 25 دقیقه - و مایع رویی آن به آرامی جدا شد. مایع جدا شده با اضافه کردن آب مقطر 25 برابر رقیق شد. 1 میلیلیتر از این مایع با 3 میلیلیتر اسید سولفوریک 96 درصد مخلوط و به شدت بهم زده شد.
سپس 0/6 میلیلیتر محلول 5 درصد وزنی فنول به آن اضافه و بهم زده شد. محلول به دست آمده به مدت 5 دقیقه در حمام آب با دماي 95 درجه سانتیگراد قرار گرفت. میزان جذب نور نمونههاي آماده شده در 490 نانومتر تعیین و با جذب نور نمونههاي استاندارد غلظت رامنوز که به روش مشابه تهیه شدند، مقایسه شد - 5،. - 7 براي تهیه نمونههاي استاندارد غلظت رامنوز از محلول محیط کشت پایه به جاي آب مقطر استفاده شد تا از اثر احتمالی مواد معدنی بر جذب نور صرفنظر شود. براي تخمین جرم رامنولیپید تولید شده باید جرم رامنوز اندازهگیري شده در عدد 2/25 ضرب شود - .
نحوه محاسبه :µ
براي محاسبه µ از رابطه مونود - 2 - 2 با سه پارامتر - رابطه - 1 استفاده شد. - 1 - , اگر فرض کنیم µ در یک بازه تغییرات کوچک CS و CN تقریبا ثابت باشد، با انتگرالگیري از رابطه فوق خواهیم داشت:
- 2 - - 3 - رابطه فوق در محدوده لگاریتمی رشد میکروارگانیسم صدق میکند. براي محاسبه µ غلظت توده میکروبی بلافاصله پس از تلقیح - x0 - و 1/5 ساعت پس از آن - x - اندازهگیري شد - مدت زمان مورد استفاده براي محاسبه سرعت اولیه رشد باید از طول فاز رشد میکروارگانیسم کمتر و تا حد ممکن کوچک باشد - . به منظور حذف خطاي ناشی از تفاوت غلظت اولیه توده میکروبی از کشتهاي بذر یکسان استفاده شد. غلظت اولیه توده میکروبی در تمامی آزمایشها تقریبا 0/2172 g/L بود. براي مشخص شدن طول فاز رشد، منحنی رشد میکروارگانیسم در غلظتهاي مختلف رسم شد.
طراحی آزمایش:
براي تعیین µ از طراحی آزمایش به روش پاسخ سطح استفاده شد. یک طرح آزمایش با دو فاکتور مورد استفاده قرار گرفت. 12 آزمایش به صورت تصادفی انجام شد. به ازاي هر دوتایی CS - ، - CN یک مقدار µ به دست آمده و با برازش دادههاي حاصله با نرم افزار LAB Fit، مقدار پارامترهاي مورد نظر محاسبه شد. در انجام آزمایشها غلظت گلیسرول بین 0/5 و 30 گرم بر لیتر و غلظت نیترات سدیم بین 0/1384 و 8/3061 گرم بر لیتر در نظر گرفته شد. در تمامی آزمایشها نسبت مولی عنصر کربن به عنصر نیتروژن برابر 10 بود. تمامی آزمایشها با دو بار تکرار انجام و میانگین نتایج به دست آمده ارائه شد.
نتایج و بحث:
منحنی رشد میکروارگانیسم در غلظتهاي مختلف گلیسرول در شکل 1 نشان داده شده است. شکل.1 منحنی رشد سودوموناس آئروژینوسا در غلظتهاي مختلف گلیسرول و نسبت مولی کربن به نیتروژن برابر .14 g/L . - b - .30 g/L . - a - .10 .0/5 g/L . - d - .4 g/L . - c - با توجه به شکل 1 میتوان نتیجه گرفت در محدودهي غلظتهاي مورد بررسی فاز لگاریتمی رشد میکروارگانیسم حداقل 10 ساعت طول میکشد. در نتیجه مدت زمان 1/5 ساعت براي نمونهگیري مناسب بوده و قابل قبول است زیرا این زمان از طول فاز لگاریتمی کمتر بوده و همچنین با توجه به کوچک بودن آن فرض عدم تغییر غلظت گلیسرول و نیترات سدیم برقرار است.
نتایج حاصل از اندازهگیري جرم خشک توده سلولی، سرعت ویژه رشد، بیشترین مقدار رامنولیپید تولیدي و مدت زمان تولید حداکثري محصول - مدت زمانی از تخمیر که در آن غلظت محصول تولیدي به بالاترین مقدار خود میرسد - در جدول 1 بیان شده استنکته. قابل توجه این است که براي افزایش دقت عمل برازش باید محدوده نسبتاً وسیعی از غلظت منبع کربن و منبع نیتروژن را در نظر گرفت . به عنوان مثال فرض کنید دادههاي تجربی فقط در غلظتهاي بالا موجود باشند؛ در این صورت kS<<CS و kN<<CN و در نتیجه دو عبارت - CS+kS - و - CN+kN - به طور تقریبی با CS و CN برابر می شوند. این موضوع باعث میشود رابطهي 1 به رابطه ي ساده ي تبدیل شده و بنابراین از برازش دادهها نتایج مناسبی براي دو پارامتر kS و kN به دست نمیآید.
