بخشی از مقاله
چکیده
پیامدهای انباشت فلزات سنگین وآلایندههای آلی در خاک خطرناک و نگران کننده است. یکی از روش های حذف آلایندههای فلزی استفاده از کیلیتها می باشد. درمیان کیلیت کنندهها بیوسورفاکتانتها به دلیل داشتن سازگاری با محیط زیست و زیست تخریب پذیری و سمیت کم از اهمیت بالای برخوردارند.
در تحقیق حاظر به منظور بررسی تاثیر pH و مدت زمان رشد بر مقدار بیوسورفاکتانت تولیدی دو باکتری باسیلوسسابتیلیس و سودوموناس پوتیدا مقدار و کیفیت بیوسورفاکتانت تولید شده از این دو باکتری در سه 6 pH، 7 و 8 و در زمانهای 4تا 12 روز در شرایط آزمایشگاهی تعیین گردید. نتایج نشان داد که در مورد هر دو باکتری در pH برابر 7 بیشترین مقدار بیوسورفاکتانت تولید شد. هرچند که تاثیر pH بر باکتری سودوموناس بیشتر بود. در این pH با افزایش زمان تولید بیوسورفاکتانت تا 6 روز افزایش یافت و با توجه به محدودیت محیط رشد به مقدار ثابتی رسید.
مقدمه
در چند دهه اخیر آلودگی محیط زیست به آلاینده های آلی و معدنی مثل فلزات سنگین به یک نگرانی عمومی تبدیل شده است . - Liao et al., 2008; Wuana and Okieimen, 2011 - از این رو پژوهش در خصوص بازسازی و پاک سازی فلزات سنگین از محیط مورد توجه قرار گرفته و روبه افزایش است . - Gusiatin and Klimiuk, 2012 - تکنیک های مرسوم کنونی برای رفع آلودگی شامل شستشو با آب، اسیدهای آلی و غیر آلی، سورفاکتانتهای شیمیایی و کیلیت کنندهها مثل EDTA میباشد . - Chakraborty and Das, 2014 - با این حال روشهای حاضر برای حذف آلایندهها اطمینان بخش نبوده و روشهای مانند عملیات حرارتی، تثبیت کردن، حفاری و دفن به دلیل کمبود فضا کمتر مورد استفاده قرار می گیرند
برای حذف مناسب فلزات از یک محیط آلوده در استفاده از کمپلکس کنندهها نیاز به یک عامل با پتانسیل کمپلکس کنندگی بالا، دارای حلالیت و پایداری زیاد در محیط زیست و مقاوم به تغییرات pH می باشد . - Juwarkar et al., 2007 - سورفاکتانت به عنوان یکی از متابولیت های فعال میکروبی جز عوامل کمپلکس کننده فلزی می باشند که در پالایش محیط از فلزات سنگین موثر گزارش شده اند .
متحرک سازی فلزات سنگین با بیوسورفاکتانت باعث فراهمی آلاینده برای گیاه در روش گیاهپالایی می شود. همچنین با توجه به سطح ایستابی و آبهای زیر زمینی می توان آلاینده را با لایه های پایینتر برد تا از دسترس گیاه زراعی کشت شده خارج شود. دلایل متعددی از قبیل سمیت کمتر - Gao et al., 2012 - ، سازگاری بهتر با محیط زیست و زیست تخریب پذیری ، پایداری در pHهای مختلف، غلظت نمک و دمای بالا استفاده از بیوسورفاکتانتها به منظور اصلاح خاک در پژوهشهای مختلف مد نظر قرار گرفته است .در سال های اخیر مطالعاتی در بررسی پتانسیل بیولوژیکی انواع بیوسورفاکتانتها برای رفع آلودگی فلزات سنگین انجام پذیرفته است
از این جهت گونه های مختلفی از بیوسورفاکتانتها با منشا باکتریای شناسایی شدهاند که در انحلال و رفع آلودگی فلزات سنگین موثر واقع گردیدهاند . - Albuquerque et al., 2012 - شرایط محیطی از جمله عواملی است می تواند بر مقدار بیوسورفاکتانت تولید شده تاثیر گذار باشد از این رو در مطالعه حاضر تاثیر دو عامل pH و مدت زمان رشد بر مقدار بیوسورفاکتانت تولید شده بوسیله دو باکتری باسیلوس سابتیلیس و سودوموناس پوتیدا مورد بررسی قرار گرفت. باکتری های انتخاب شده در مطالعات مختلف در ضمینه تولید بیوسورفاکتانت مورد بررسی قرار گرفتند و هر دو باکتری بیوسورفاکتانت ازجنس Rhamnolipid تولید می کنند .
مواد و روشها
جهت تولید، استخراج و خالص سازی نسبی بیوسورفاکتانت ابتدا باکتری در یک ارلن حاوی 200 میلی لیتر محیط MRS broth کشت داده شد و به مدت سه شبانه روز در دمای 30 درجه سلسیوس بر روی شیکر با سرعت 150دور در دقیقه گرمخانه گذاری شد. سپس محتویات ارلن به مدت 20دقیقه در دمای 4 درجه سلسیوس و دور 14000 دور در دقیقه با استفاده از سانتریفیوژ یخچالدار سانتریفیوژ شد تا سلولهای باکتریایی کاملا ته نشین شوند. سپس توسط اسید کلریدریک 1 نرمال، pH مایع رویی به 2 رسانده و به مدت یک شبانه روز در دمای 4درجه سلسیوس قرار داده شد تا بیوسورفاکتانت رسوب کند.
رسوب قهوهای حاوی بیوسورفاکتانت با استفاده از سانتریفیوژ در دمای 4 درجه سلسیوس به مدت 20 دقیقه در 12000 دور در دقیقه جداسازی شد. جهت خالص سازی نسبی بیوسورفاکتانت، 10میلی لیتر مخلوط کلروفرم/متانول به نسبت 2:1 به رسوب بدست آمده افزوده شد و به مدت 15دقیقه بر روی شیکر با سرعت 150 دور در دقیقه در دمای 30 درجه سلسیوس قرار داده شد.
این ترکیب دوباره در 12000دور بر دقیقه به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سلسیوس سانتریفیوژ گردید. سپس مایع رویی در گرمخانه در دمای40 درجه سلسیوس قرار داده شد تا کاملا خشک شود. در نهایت بیوسورفاکتانت به صورت رسوب سفید رنگ از مایع رویی بدست آمد . - Mukesh Kumar, 2012 - کیفیت بیوسورفاکتانت تولید شده در هر مرحله آزمایش به صورت کیفی از طریق تست روغن مورد بررسی قرار گرفت. به این صورت که مقدار 30 میلی لیتر آب مقطر درون یک پتری دیش ریخته و 250 میکرولیتر روغن مایع خوراکی بصورت یک لایه نازک به سطح آن اضافه شد. سپس100میکرولیتر از مایع کشت باکتری به سطح روغن اضافه گردید. کنار رفتن روغن و مشاهده ناحیه شفاف در سطح آب موید حضور بیوسورفاکتانت است
جهت بررسی تاثیر pH اولیه بر مقدار بیوسورفاکتانت تولیدی محیط کشت باکتریها - NB - در pH های 6 ، 7 و 8 با استفاده از با NaOH و HCl تنظیم شد سپس بیوسورفاکتانت تولید شده بوسیله دو باکتری مورد مطالعه در این محیط کشتها در دمای 30 درجه سانتی گراد بعد از 6 روز استخراج و مقدار آن اندازه گیری شد. تاثیر مدت زمان رشد بر مقدار تولید بیوسورفاکتانت در زمانها 4 تا 12 روز در دمای 30 درجه سانتی گراد و در pH مطلوب که از آزمایش قبل بدست آمد بررسی گردید.
نتایج و بحث
نتایج نشان داد که pH برمیزان تولید بیوسورفاکتانت اثرگذار بوده و هردو باکتری بیشترین میزان تولید را در pH خنثی داشتند - شکل . - 1 مطابق شکل 1 تاثیر pH برروی باکتری باسیلوسسابتیلس بیشتر از باکتری سودوموناس پوتیدا در تولید بیوسورفاکتانت بود. نتایج بدست آمده از این مطالعه با نتایج بدست آمده در دیگر تحقیقات مشابه بود
شکل -1تاثیر pH بر بیوسورفاکتانت بوسیله دو باکتری باسیلوسسابتیلس و سودوموناس پوتیدا
تاثیر مدت زمان رشد بر میزان بیوسورفاکتانت تولیدی تاثیر گذار بود و در هر دو باکتری تولید بایوسورفاکتانت تا 6 روز اول روند افزایشی داشت اما بعد از 6 روز تولید روند ثابتی پیدا کرد، احتمالا تولید بایوسورفکتانت بعد از رسیدن باکتری به حداکثر میزان رشد باتوجه به ظرفیت محدود محیط کشت کاهش یافته است.
در دیگر مطالعات نیز گزارش شده است که تولید بیوسورفاکتانت و دیگر متابولیت های باکتری از الگوی رشدی آن در محیط کشت تبعیت می کند و با آن منطبق است به طوری که با افزایش تعداد باکتری در محیط کشت تولید این متابولیت ها افزایش می یابد و با نامساعد شدن شرایط محیط کشت بویژه محدودیت منابع غذایی از تولید آنها کاسته شده و روند تغییرات این متابولیتها ثابت میماند
شکل -2 تاثیر مدت زمان رشد بر مقدار تولید بایوسورفاکتانت بوسیله دو باکتری باسیلوسسابتیلس و سودوموناس پوتیدا
