بخشی از مقاله
چکیده
آنزیم لیپاز در صنایع گوناگون از جمله شوینده ها، صنایع غذایی و داروسازي کاربرد دارد. در این پژوهش جدایه هاي باکتریایی از پساب کارخانجات روغن نباتی جداسازي شده و مقدار آنزیم تولید شده توسط جدایه ها در محیط کشت جامد حاوي تري بوتیرین به عنوان سوبستراي روغنی مقایسه شد. یک جدایه باکتریایی که هاله اي به قطر 15 میلی متر را تشکیل داده بود انتخاب شده و پس از رشد در محیط کشت مناسب، فعالیت لیپاز خارج سلولی آن در روشناور محیط کشت به میزان U/ml 41.5 با روش پارا نیترو فنیل پالمیتات و همچنین کیت آنزیمی سنجش لیپاز تعیین گردید.
جدایه منتخب با روش مولکولی 16s rRNA، توالی یابی و همردیفی به عنوان یک گونه از سودوموناس شناسایی و با نام Pseudomonas L.M در بانک ژن ثبت شد. سپس ثوابت سینتیکی Km ,Vm آنزیم به ترتیب به میزان 49.5 - mol/ml.min - و 0.77 - mM - از رسم منحنی لاین ویوربرك محاسبه شدند که مقدار کم Km نشان دهنده تمایل زیاد آنزیم به سوبسترا است. با رسم منحنی آرنیوس، انرژي اکتیواسیون واکنش آنزیمی 20.78 kJ/mol و فاکتور Q10 برابر 4.39 به دست آمد که به ترتیب نشان دهنده سرعت بالاي واکنش آنزیمی و وابستگی دمایی آن می باشد.
مقدمه
هیدرولازها مانند لیپازها، پروتئازها، آمیلازها، سلولازها و استرازها بخش عمده اي از بازار آنزیم هاي صنعتی - حداقل - %75 را در برمی گیرند. در این میان لیپازها به دلیل کاربرد گسترده در صنایع مختلف از جمله تولید شوینده ها، صنایع غذایی، داروسازي، کشاورزي و اخیرا به عنوان کاتالیست واکنشهاي ترانس استریفیکاسیون براي تولید سوخت پاك از اهمیت فراوانی برخوردارند . - 7 - لیپازها EC - 3.1.1.3 - تري اسیل گلیسرول ها را به گلیسرول و اسیدهاي چرب آزاد هیدرولیز می نمایند و می توانند در حضور الکل، تري اسیل گلیسرول ها را به گلیسرول و استر اسیدهاي چرب کاتالیز کنند. - 7 -
میکروارگانیسم ها به دلیل تولید انواع زیادي از آنزیم ها با فعالیت کاتالیتیکی گوناگون، عملکرد بالا، دستکاري ژنتیکی آسان و رشد سریع در محیط هاي کشت ارزان گزینه مناسبی براي تولید انواعی از آنزیم هاي صنعتی به شمار می روند . - 7 - با توجه به اهمیت آنزیم لیپاز در صنایع گوناگون و عدم تولید آن در داخل کشور و هزینه هاي بالایی که صرف واردات آن می شود، یافتن میکروارگانیسم مولد لیپاز از منابع داخلی ضرورت می یابد. هدف از این پژوهش یافتن یک میکروارگانیسم مولد لیپاز و بررسی برخی ویژگی هاي آنزیم بود. این جستجو در میان پساب و بخش هاي مختلف چند کارخانه روغن نباتی انجام گرفت. غربال گري بر اساس ایجاد هاله شفاف در محیط کشت اختصاصی انجام شد. برخی ویژگی هاي آنزیم از جمله ثوابت سینتیکی و پارامترهاي ترمودینامیکی تعیین شدند.
مواد و روش ها
نمونه گیري: ابتدا نمونه گیري با رعایت شرایط آسپتیک در ظروف استریل و با پیپت و پنس استریل از پساب و بخش هاي مختلف کارخانجات روغن نباتی قو، مارگارین و اکسدانه انجام گرفت و شرایط دمایی و pH محیط برداشت نمونه ها یادداشت شد و نمونه ها به سردخانه منتقل گردید. غربال گري و جداسازي: نمونه هاي مایع در صورت لزوم و نمونه هاي جامد با سرم فیزیولوژي رقیق و به خوبی به هم زده شدند و سپس از فاز آبی به میزان مناسب به محیط کشت جامد منتقل شدند.
با پاساژهاي متوالی کلنی هاي خالص مجزا به دست آمد. باکتري هاي تفکیک شده روي محیط هاي کشت جامد حاوي - گرم بر لیتر - : عصاره مخمر - , - 5 کلرید سدیم , - 10 - تریپتون - 10 - وتري بوتیرین10 - میلی لیتر بر لیتر - منتقل شده و به مدت 24 ساعت در دماي 37 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. جدایه مولد لیپاز قادر به هیدرولیز تري بوتیرین و ایجاد هاله شفاف بر روي این محیط است. جداسازي بر اساس قطر هاله شفاف انجام شد.
شناسایی: DNA باکتري مولد لیپاز با کیت DNA fast استخراج شد. سپس براي اطمینان از کیفیت DNA مقدار 5 l از نمونه DNA روي ژل آگارز %1 منتقل و رنگ آمیزي شد. سپس PCR با الگوي: dNTP - 0.5 l - ، Taq - 0.2 l - Primer Forward - 0.5 l - ، ,MgCl2 - 0.8 l - ,Buffer 10x - 2.5 l - ,Primer reverse - 0.5 l - - 3 l - نمونهddH2O - 17 l - , DNA و با برنامه دماي دناتوره 30 , 940 C سیکل با دماي94 0 C به مدت 1 دقیقه , دماي 54 0 C دماي جفت شدن1، دماي 72 0 C به مدت 10 دقیقه و دماي نگهداري 4 0 C انجام شد. باند روي ژل آگارز %1 مشاهده، سپس تعیین توالی و همردیفی انجام شد.
بررسی رشد و تولید لیپاز: باکتري موردنظر براي ترشح آنزیم لیپاز در محیط اصلاح شده شامل : - w/v - پپتون %2، ,فسفات دي هیدروژن پتاسیم %0.1، هپتاهیدرات سولفات منیزیم 0.05%، عصاره مخمر%0.1 و روغن زیتون% 1 با pH برابر 7و دماي 37 0 C در شیکر انکوباتوربا دور 150 rpm رشد داده شد . - 8 - رشد باکتري - OD600nm - و میزان فعالیت لیپاز اندازه گیري شد. تعیین فعالیت آنزیم: براي سنجش کیفی ترشح لیپاز از محیطی حاوي تري بوتیرین - ml/l - 10 و آگار 15 - g/l - استفاده شد.
براي این منظور ابتدا باکتري به مدت 24 ساعت در دماي 37 درجه سانتیگراد در دور 150 rpm در محیط اصلاح شده رشد داده شد و سپس با دور 5000 در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شد و روشناور که حاوي لیپاز خارج سلولی بود به دیسک بلانک موجود در پلیت حاوي تري بوتیرین منتقل شد و پس از 24 ساعت قطر هاله اندازه گیري شد. براي سنجش کمی لیپاز از روش پارا نیترو فنیل پالمیتات - 4 - و همچنین کیت تشخیص کمی لیپازاستفاده شد - شرکت پارس آزمون - .
تعیین ویژگی آنزیم: مقدار Vm و Km آنزیم با اندازه گیري فعالیت آنزیم در حضور غلظت هاي مختلف پارانیتروفنیل پالمیتات به عنوان سوبسترا به دست آمد. طبق رابطه آرنیوس، انرژي اکتیواسیون از معادله [1] و با رسم LnV برحسب 1/T و تغییرات انرژي آزاد گیبس - G* - ، آنتالپی - H* - ، انتروپی - S* - و ضریب دمایی Q10 از معادلات [5-2] محاسبه گردید. در این معادلات، Ea انرژي اکتیواسیون - kJ/mol - ، T دما - درجه کلوین - و R ثابت گازها - 8.314 kJ/mol.K - است.
نتایج و بحث
غربال گري و جداسازي: 5 نمونه باکتري و5 نمونه قارچ از کارخانه مارگارین، 10 نمونه باکتري و 3 قارچ از کارخانه قو و 2 قارچ از کارخانه اکسدانه به دست آمد که تنها یک جدایه باکتریایی و یک جدایه قارچی توانایی تولید آنزیم لیپاز با ایجاد هاله هایی به قطر 20-15 میلی متر داشتند.
