بخشی از مقاله
چکیده
پلیهیدروکسیبوتیرات - PHB - یکی از شناختهشدهترین مشتقات خانواده پلیهیدروکسیآلکانواتها هستند که به دلیل زیستتخریب-پذیری، زیستسازگار بودن و داشتن خواص مشترک با پلاستیکهای معمول با پایه نفتی همچون پلیاتیلن موردتوجه قرار گرفتهاند. یکی از مشکلات موجود بر سر راه تولید این پلاستیکهای زیستی هزینه تولید آنها است، که در این پژوهش این مشکل با استفاده کردن از ویناس، - پساب کارخانه الکلسازی - به عنوان سوبسترا رفع شده و محصول با ارزشافزوده بالا نیز از آن استخراج شده است. این پلیمر با روشهای کمی جذب سنجی و کیفی رنگآمیزی سودان سیاه آنالیز شد. این پلیمر در محیط کشت ویناس %10 رقت توسط ریزاندامگان هالوفیل در روز اول رشد خود بیشترین غلظت را داشته که میزان آن برابر 26/76 میلیگرم برلیتر میباشد.
واژههای کلیدی:پلیهیدروکسیبوتیرات، ویناس سوبسترای ارزانقیمت، ریزاندامگان هالوفیل
مقدمه
امروزه در زندگی مدرن، پلاستیکها موادی هستند که در جنبههای مختلف زندگی بشر کاربردهای فراوانی همچون کاربردهای خانگی، تجهیزات کامپیوتری، صنایع بستهبندی و غیره دارند. اغلب پلاستیکهای مصرفی از مواد نفتی تشکیل میشوند که مصنوعی بوده و به دلیل عدم تجزیهپذیری دوستدار محیطزیست نیستند .[1] به همین دلیل پلاستیکهای زیستی که قابلیت تجزیهپذیری کامل را دارند و از منابع تجدیدپذیر تولید میشوند، سازگار با محیطزیست بوده و نیز به دلیل داشتن خواصی مشابه با پلاستیکهای تولیدشده بر پایه مواد نفتی همچون پروپیلن و پلیاتیلن مورد توجه قرار گرفتهاند .[2]
هزینه بالای تولید این پلیمرهای زیستی علیرغم کاربردهای فراوان در پزشکی، صنعت و کشاورزی و غیره باعث شده است که تولید این پلیمرها از نظر اقتصادی مقرونبهصرفه نباشد .[3] قیمت عمده هزینه تولید 1 PHAمربوط به فرآیند تخمیر، سوبسترا و استخراج محصول درونسلولی میباشد، بهطوریکه حدود %35 قیمت تمامشده، مربوط به منبع کربن و %40 آن مربوط به مراحل پایین-دستی و جداسازی میباشد .[4]با توجه به مطالب ذکرشده برای کاهش هزینه تولید، یک راهبرد، استفاده از منابع کربن ارزانقیمت همچون ملاس چغندرقند و شربت ذرت خیسانده [5]، آبپنیر [6] و پسماندهای کشاورزی همچون شیره خرما میباشد .[7]
ویناس، یکی دیگر از منابع ارزانقیمت میباشد که بعد از تخمیر ملاس چغندرقند و تقطیر اتانول،ویناس بهعنوان پساب باقی می-ماند.[8] از ملاس به ازای هر لیتر اتانول تولیدی، 15 لیتر ویناس تولید میشود که به دلیل pH پایین، دمای بالا و رنگ تیره و حجم بالای تولید این پساب [3] و 2COD بالای 50000 بهعنوان یکی از مشکلآفرینترین پسابها به شمار میآید .[8]هدف از این پژوهش تولید پلیمر زیستی 3 PHB بهعنوان محصول با ارزشافزوده بالا با استفاده از ویناس، پساب کارخانه الکلسازی است. ویناس به عنوان منبع ارزانقیمت کربن برای پایین آوردن هزینه تولید پلیمر دوستدار محیط زیست مورد استفاده قرار میگیرد.
مواد و روشها
در این پژوهش از ویناس، پساب کارخانه الکلسازی بیدستان قزوین استفاده شد که تولید اتانول در این مجموعه از منبع اولیه ملاس چغندرقند بوده است که پس از طی فرآیند تخمیر و تقطیر اتانول این پساب بهجای میماند.ریزاندامگان مورداستفاده در این پژوهش، گونهای معتدل نمکدوست میباشد که توانایی تولید PHB توسط این باکتری مورد مطالعه قرار گرفته است. این گونه از دریاچه ارومیه جداسازی شده است و از سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران تهیه گردیده است.
کشت و نگهداری ریزاندامگان
ریزاندامگان مورد نظر توسط لوپ استریل از اسلنت به محیط کشت بذر پیشنهادی توسط سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران با ترکیب ذیل تلقیح شد:کلرید سدیم، 80 گرم؛ کازآمینواسید، 7/5 گرم؛ پروتئوس پپتون، 5 گرم؛ عصاره مخمر، 1 گرم؛ سیترات سدیم، 3 گرم؛ سولفات-منیزیم.7آبه، 7 گرم؛ دیپتاسیمهیدروژنفسفات، 0/5 گرم؛ سولفات-آهنآمونیوم.6آبه، 0/05 گرم؛ آگار، 15 گرم و آب مقطر، 1 لیتر.برای رشد باکتری، pH بر روی 7 تنظیم شد و نمونهها در دمای 30 درجه سانتیگراد و شدت تکاندهی 150 به مدت 24 ساعت گرماگذاری شد.بعد از بررسی روند رشد باکتری و رسم منحنی رشد و تعیین زمان حداکثر رشد باکتری در فاز لگاریتمی، این باکتری پس از 24 ساعت گرماگذاری با اضافه کردن %10 گلیسرول به محیط کشت بذر به اپندورف انتقال داده شد و در دمای منفی 70 درجه سانتیگراد نگهداری شد.
محیط کشت تولید PHB
محیط کشت تولید PHB با توجه به نقش ذخیره انرژی و کربن درونسلولی که برای باکتری دارد[9]، اغلب در محدودیت مواد مغذی اتفاق میافتد، و یکی ا ز این محدودیتها کمبود نیتروژون و یا به عبارتی دادن کربن اضافی به محیط کشت است.به همین دلیل در این پژوهش از پساب کارخانه الکلسازی به عنوان منبع کربن ارزانقیمت و مازاد برا ی محیط کشت استفاده شده است که ابتدا باید ریزاندامگان در محیط اختصاصی خود با تلقیح %1 بذر اولیه گرماگذاری شده و رشد کنند و پس از رسیدن به حداکثر رشد خود به پساب که محیط کشت تولید PHB با منبع کربن اضافی است تلقیح شوند.برای استفاده از این پساب میتوان ابتدا بر روی آن فرآیند پیش تیمار انجام داد:
· پساب خام: استفاده از پسابی که به طور مستقیم از کارخانه گرفته شده است.
·پساب فیلتر شده: پسابی که جامدهای معلق آن توسط کاغذ صافی واتمن 0,45 میکرون حذف شده است.
·پساب پروتئین زدایی شده: پسابی که pH آن ابتدا با استفاده از سود و یا اسید سولفوریک 1 نرمال بر روی 7 تنظیم شده است سپس به مدت 30 دقیقه جوشانده شده تا پروتئین ها تهنشین شوند و توسط سانتریفوژ یخچالدار 1500g به مدت 20 دقیقه حذف شده و روماند نیز توسط کاغذ صافی واتمن صاف شود.در این پژوهش از پساب فیلتر شده استفاده شده است به این ترتیب که پساب فیلتر شده با کاغذ صافی به عنوان محیط کشت تولید، استریل شده تا هر نوع ریزاندامگان موجود در پساب از بین برود و بتوان از کشت خالص باکتری مورد نظر بر روی پساب تلقیح نمود. برای بررسی رشد و تولید PHB ابتدا از پساب ویناس با رقت %10 استفاده شد و به محیط کشت تولید %1 از مایه بذر تلقیح شد و روند رشد باکتری و تولید PHB طی 4 روز رصد شد.
روش کیفی بررسی تولید PHB
رنگآمیزی سودان سیاه
ابتدا گسترش میکروبی از باکتری تهیه شد و محلول سودان سیاه 0,3 - گرم پودر سودان سیاه + اتانول - %70 به مدت 10 دقیقه روی گسترش میکروبی تثبیتشده ریخته شد. پس از شستشو با آب و خشک کردن آن با کاغذ صافی، لام با زایلن تا شفاف شدن کامل شستشو داده شد. سپس سطح لام با 0,5 درصد سافرانین به مدت 15-10 ثانیه آغشته و پس از شستشو با آب و خشک کردن، باکتریها با لنز 100 میکروسکوپ مشاهده شدند. سلولهای باکتری قرمزرنگ و ذرات PHB به رنگ آبی تیره قابلمشاهده هستند.
روش کمی تعیین میزان PHB
برای آمادهسازی نمونه با استفاده از روش جذب سنجی، ابتدا به توده زیستی حاصل از محیط کشت تولید، 10 میلیلیتر محلول %7-5 هیپوکلریتسدیم اضافه شد و به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد گرماگذاری شد. با این کار دیواره سلولی باکتری با محلول هیپوکلریتسدیم تماس داده شد ه و در آن حل شده و دانههای PHB از سلول خارج شدند. .پس از اتمام این مدتزمان، از طریق سانتریفوژ گرانولهای PHB از مابقی محلول جدا شدند. آنگاه بر روی گرانولها 10 میلیلیتر اتانول %96 اضافه شد که باعث کاهش انحلالپذیری PHB شده و رسوبی مشاهده شد.در آخرین مرحله از مراحل شستشو با حلال، 10 میلیلیتر استن اضافه شد و پس از سانتریفوژ به دلیل فراریت استن، استن از ظرف خارجشده و هاله سفیدرنگ PHB پدیدار گشت.
در این مرحله 2 میلیلیتر کلروفرم به نمونهها اضافه کرده و پس از اطمینان از بسته بودن درپوشها، لولهها را به مدت 3 تا 4 ساعت درون حمام آبی که به دمای 100 درجه سانتیگراد رسیده قرار داده و پس از طی زمان یادشده، دمای حمام را روی 57 درجه سانتیگراد تنظیم کرده و سپس درپوشها را باز کرده تا کلروفرم بهآرامی تبخیر شود و هاله سفیدرنگ دوباره پدیدار شود.در مرحله پایانی آنالیز، 10 میلیلیتر اسیدسولفوریک %98 به لولهها اضافه شد و در ترموراکتور با دمای 100 درجه سانتیگراد قرار داده تا واکنش PHB با اسیدسولفوریک انجامشده و با از دست دادن آب به کروتونیکاسید تبدیل شود. جذب نمونههای آمادهشده با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طولموج 235 نانومتر خوانده شد و میزان PHB براساس منحنی کالیبراسیونی که توسط PHB استاندارد تهیه شده است محاسبه شد.
نتایج
ریزاندامگان هالوفیل بر روی محیط کشت اختصاصی کشت داده شد و پس از رسیدن به کلنیهای تک که از نظر رنگ و شکل ظاهری مشابه هم هستند و در شکل 1 نشان داده شده است از عدم آلوده بودن آنها اطمینان حاصل شد.برای حصول اطمینان بیشتر از رنگآمیزی گرم نیز استفاده شد و مشاهده باسیلهای میلهای به رنگ صورتی در شکل 2 عدم آلودگی محیط را تائید کرد.پس از اطمینان از عدم آلودگی، محیط کشت بذر آماده شد و بذر با درصد تلقیح %5 به محیط کشت اصلی تولید PHB اضافه شد و روند تولید PHB در 4 روز مورد بررسی قرار گرفت. در این پژوهش از محیط کشت ارزانقیمت ویناس در رقتهای %5 و %10 بدون اضافه کردن هیچ نوع مادهای به محیط، حتی مواد کممقدار استفاده شد. برای بررسی تولید PHB روزانه نمونهای از ارلنها گرفته شد و آنالیز کیفی توسط رنگآمیزی سودان سیاه انجام شد که در شکل 3 قابلمشاهده است.برای آنالیز کمی از دستگاه اسپکتروفوتومتری استفاده شد و جذب نمونهها در طولموج 235 نانومتر و با بلنک اسیدسولفوریک خوانده شد. برای استفاده از این روش ابتدا منحنی استاندارد با استفاده از PHB استاندارد آلدریچ در غلظتهای مختلف مطابق شکل 4 به دست آمد.
نتیجهگیری و جمعبندی
طبق بررسیهای انجامشده بیشترین میزان تولید PHB در این باکتری در روز اول بیشینه بوده است و میزان آن برای نمونهای که در محیط کشت ویناس %5 رقت تولیدشده اند غلظتی برابر با 26/49 میلیگرم برلیتر و برای ویناس %10 رقت غلظت برابر 27/76 میلی-گرم بر لیتر به دست آمد. علت افزایش غلظت PHB در رقت بیشتر، به دلیل وجود منبع کربن بیشتری است که در اختیار ریزاندامگان قرار میگیرد.
