بخشی از مقاله
چکیده:
آلژینات یک پلیساکارید خطی میباشد که مصارف گوناگونی از جمله در صنعت غذا و دارو دارد. آلژینات تجاري از جلبک هاي قهوه اي دریایی استخراج می شود اما تولید آن توسط باکتري ها نیز امکان پذیر است. هدف از این تحقیق تولید آلژینات توسط باکتري Pseudomonas putida با استفاده از منابع قندي ارزان قیمت که از جمله ضایعات صنایع غذایی هستند می باشد. منابع کربن مورد استفاده شامل شیره خرما، شیره انجیر و ملاس بود. تخمیر در درون شیکر بن ماري در دماي 30°C صورت پذیرفت و نمونه برداري در طی 120 ساعت فرآیند تخمیرانجام گرفت. هم چنین در این مطالعه میزان صمغ تولیدي توسط هر یک از سه محیط کشت تخمیر مذکور و نیز قند ساکاروز به عنوان محیط شاهد مورد مقایسه قرار گرفت. به منظور آنالیز صمغ تولیدي و مقایسه آن با صمغ تجاري از آزمون هاي اسپکتروسکوپی FTIR و کروماتوگرافی لایه نازك استفاده شد. نتایج بدست آمده حاکی از آن بود که میزان آلژینات تولیدي در محیط کشت تخمیرحاوي شیره خرما و یا شیره انجیر به مراتب خیلی بیشتر از ملاس بود که به دلیل ساده تر بودن قند هاي موجود در شیره ي خرما و انجیر نسبت به ملاس و تنوع مواد معدنی موجود در شیره ي خرما و انجیر می باشد که باعث افزایش میزان رشد میکرو ارگانیسم و تولید صمغ می گردد.
کلمات کلیدي: آلژینات، سودوموناس پوتیدا، اسپکتروسکوپی FTIR، کروماتوگرافی لایه نازك
مقدمه:
آلژینات یک پلیساکارید خطی میباشد که از مقادیر متعددي - 1-4 - -B-D- mannuronic acid و L-guluronic acid - G - تشکیل شده است. ایجاد وزیسکوزیته و توانایی تشکیل ژل از مهمترین جنبههاي تجاري آلژینات میباشد که این دو خاصیت تحت تأثیر توزیع مناطق M و G و همچنین طول زنجیره میباشند . - 2 - آلژیناتهایی که شامل پلیگلورونات هستند، در حضور یون کلسیم ژلهاي سفتی تشکیل میدهند. مقاومت و سفتی بافت آلژینات همچنین به میزان پیوندهاي عرضی بین زنجیرهها و نوع یون ایجادکنندهي پیوند بستگی دارد. آلژینات را میتوان توسط میکروارگانیسم هایی همچون Azotobacter vinelandii و گونه هایی از سودوموناس مثل سودوموناس پوتیدا تولید کرد . - 11 - قیمت بالاي منبع کربن محیط کشت تخمیر که عموما قندهایی نظیر گلوکز، فروکتوز و ساکاروز می باشند، اثر مستقیمی بر روي هزینه ي تولید آلژینات می گذارند که این عامل محدود کننده اي در تولید صنعتی آلژینات ها می باشد، بنابراین یافتن منابع کربنی ارزان قیمت براي کاهش هزینه هاي تولید امري اجتناب ناپذیر می باشد.
محصولاتی مانند خرما و انجیراز جمله محصولات تجاري ارزشمند می باشند که در کشورهاي تولید کننده با یک سیر افزایشی تولید می شوند، در صورتی که صنایع فراوري آن ها به همان سرعت رشد پیدا نکرده است . - 5 - با این حال در شرایط نامساعد آب و هوایی میزانی از خرما و انجیر آسیب دیده و هم چنین قسمت اعظمی از محصول نیز مورد تهاجم حشرات و پرندگان قرار می گیرد که موجب کاهش کیفیت و از بین رفتن محصول می گردد. هم چنین تحقیقات نشان داده است که می توان از ملاس به عنوان ضایعات صنایع قند به عنوان یک جایگزین منابع قندي استفاده کرد. لذا در این تحقیق از خرما و انجیري با کیفیت پایین به عنوان منبع ارزان قیمت و هم چنین ملاس براي تولید صمغ با استفاده از باکتري Pseudomonas putida استفاده گردید و بازده تولید آلژینات توسط هر کدام از محیط هاي کشت تخمیر حاوي قند خرما، قند انجیر و ملاس مقایسه شد و نیزخصوصیات صمغ تولیدي مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش ها: - تولید آلژینات
تولید آلژینات در دو مرحله انجام شد ، در مرحله ي اول سلول هاي میکروارگانیسم در داخل محیط اولیه جهت فعال سازي کشت گردید و سپس در مرحله ي دوم این محیط اولیه به داخل محیط هاي تخمیر حاوي شیره ي خرما، شیره انجیر و ملاس انتقال داده شد . - 4 - میکروارگانیسم مورد استفاده در این تحقیق باکتري Pseudomonas putida با 1694 PTCC بود که از پژوهشکده ي بیوتکنولوژي سازمان هاي پژوهش هاي علمی و صنعتی ایران تهیه گردید. این میکروارگانیسم ابتدا در محیط Nutrient broth در دماي 25°C به مدت بیست و چهار ساعت گرمخانه گذاري فعال گردید . - 9 - ده میلی لیتر محیط Nutrient broth حاوي میکروارگانیسم فعال شده به داخل ارلن مایر 500 میلی لیتري حاوي 200 میلی لیتر از محیط کشت Mineral salt - MS - با ترکیب K2 HPO4 0.75 g/L ، 0.2009 g/L FeSO4 .7H 2O و گلوکز 10g/L انتقال داده شد.
pH این محیط در 7 تنظیم گردید . - 1 - ارلن حاوي محیط کشت اولیه تلقیح شده در داخل شیکر بن ماري در rpm150 و دماي 300C براي مدت 24 ساعت قرار داده شد. سپس محیط تخمیر به دست آمده درشرایط استریل در 2800 g به مدت 30 دقیقه سانترفیوژ گردید و سلول هاي میکروارگانیسم سه مرتبه با محلول500- 400 cmاستریل سیلین شستشو داده شد سپس 5 میلی لیتر از محلول سیلین حاوي سلول هاي میکروارگانیسم با جذب 0.6 در طول موج 650 nm به داخل ارلن مایرهاي 125 میلی لیتري حاوي 50 میلی لیتراز محیط تخمیر استریل با ترکیب شیره ي خرما انتقال داده شد. براي ساخت محیط تخمیراز شیره ي خرما، شیره انجیر و ملاس با بریکس 10 استفاده گردید. محلولهاي قندي قبل از استفاده در محیط هاي تخمیر در 10000 gبه مدت 30 دقیقه سانترفیوژ شدند تا کلیه مواد نامحلول ار آن خارج گردد. هر سه نوع محیط تخمیر حاوي 1/25g/ L K 2 HPO4 ، 5g/ L peptone و g/ L 0/2 yeast extract بود و pH این محیط در 7 تنظیم گردید. ارلن هاي حاوي محیط تخمیر مشابه شرایط قبل مخلوط گردید و سپس بعد از هر 24 ساعت از محیط هاي تخمیرنمونه برداري صورت گرفت و میزان صمغ تولیدي در هر نمونه اندازه گیري شد . - 10 - کلیه این آزمایشات در سه تکرار انجام پذیرفت.
- جداسازي آلژینات از محیط تخمیر:
استخراج آلژینات از محیط تخمیر بر اساس ترسیب با استفاده از اتانول %96 صورت گرفت. بعد از کامل شدن زمان تخمیر، محیط هاي بدست آمده در10000 g به مدت 30 دقیقه سانترفیوژ گردیدند تا کل سلول هاي میکروارگانیسم از داخل محیط خارج گردند. سپس به مایع فوقانی که حاوي آلژینات بود، 3 برابر حجمی آن، اتانول %96 به محیط تخمیر اضافه گردید تا آلژینات رسوب نماید. رسوب حاصله با استفاده از سانترفیوژ در 1000 g به مدت 20 دقیقه جمع آوري شد و سه مرتبه با اتانول %96 شستشو گردید . - 8 -
- تعیین خصوصیات ساختاري صمغ آلژینات:
-آنالیز اگزوپلی ساکارید توسط اسپکترومتر :FT-IR
نمونه پودري آلژینات تولیدي با پودر KBr مخلوط و سپس تحت فشار بالا از آن قرص تهیه شد و با استفاده از دستگاه طیفسنج - - EQUINOX 55, Germany، اسپکتروم مادون قرمز آلژینات در طول موج-1به دست آمد . - 12 -
- آنالیز اگزوپلی ساکارید توسط کروماتوگرافی لایه نازك : - TLC -
ابتدا نمونه آلژینات % 3 حجمی- حجمی توسط 15ml اسید کلریدریک 0/1 نرمال در دماي 90 c به مدت 3 ساعتهیدرولیز اسیدي شد ونمونه حاصله جهت کروماتوگرافی مورد استفاده قرار گرفت. قندهاي مانورونیک اسید و گلوکورونیک اسید به عنوان شاهد به کار رفتند. نمونه ها بر روي صفحات از جنس سیلیکاژل به صورت محلول v 4 : 4 :1 : -3 کلرومتانول- متانول- استیک اسید وآب لکه گذاري شدند. سپس به منظور قابل رویت شدن لکه ها از سولفوریک- انیزآلدهید وحرارت 100°C به مدت 5 دقیقه استفاده شد - . - 3
-آنالیز آماري:
کلیه ي تست هاي انجام شده در سه تکرار و آنالیز کلیه ي داده هاي بدست آمده با استفاده از روش One-way ANOVAانجام شد. براي ارزیابی اختلاف میان میانگین ها Duncan’s multiple range test مورد استفاده قرارگرفت.
