بخشی از مقاله
چکیده
آنزیم لیپاز در فرایند تخمیر حالت جامد با بکارگیري سویه قارچی رایزوپوس اورایزا PTCC 5176 در یک بیوراکتور سینیدار تولید گردید. این بیوراکتور شامل دو سینی میباشد که در فواصل مساوي از هم در داخل بیوراکتور قرار گرفتهاند. همچنین از تفاله نیشکر - باگاس - بعنوان سوبستراي چامد بهره گرفته شد. رطوبت و درجه حرارت داراي تأثیرات جشمگیري بر میزان رشد میکروبی در مقیاسهاي بزرگ میباشند و بنابراین به منظور افزایش مقیاس در راکتورهاي سینیدار کنترل دقیق این پارامترها ضروري است. در این بیوراکتور درجه حرارت و رطوبت کنترل شده و در سطح بهینه نگه داشته شدند. همجنین زمان انجام فرایند تخمیر بعنوان پارامتري موثر در رشد سلولی و تشکیل بیومس مطرح بوده است.
به فاصله زمانی 24 ساعت و به مدت پنج روز از سینیهاي موجود در داخل بیوراکتور نمونه گرفته شده و میزان فعالیت آنزیم مورد بررسی قرار گرفت. حداکثر فعالیت لیپاز تولیدي پس از گذشت 48 ساعت از شروع تخمیر بدست آمد که مقدار آن براي سینی بالائی برابر با 132/57 U/gdss و براي سینی پائینی برابر با 108/12U/gdss میباشد. رطوبت داخلی بیوراکتور به میزان %80 و درجه حرارت محفظه داخلی بیوراکتور به میزان 45°C منجر به تولید لیپاز با فعالیت بالا به ترتیب به میزان 79/77 U/gdss و 170/66 U/gdss در سینی بالائی و 76/57 U/gdss و 93/37 U/gdss در سینی پایینی گردید.
واژههاي کلیدي: تخمیر حالت جامد، لیپاز، بیوراکتور سینیدار، فعالیت آنزیم، تفاله نیشکر
-1مقدمه
لیپازها - هیدرولیزهاي گلیسرول استر - EC 3.1.1.3 گروهی از آنزیم ها هستند که تري آسیل گلیسرولها را به اسیدهاي چرب، دي-آسیل گلیسرولها، مونوآسیل گلیسرولها و گلیسرول تبدیل کرده و تحت شرایط معینی، واکنش هاي معکوسی از قبیل استریفیکاسیون و ترانس استریفیکاسیون را کاتالیز می کنند.[3-1] لیپاز همچنین داراي خواص ویژهاي مانند اختصاصی بودن سوبسترا، گزینشپذیري استري1 و توانایی کاتالیز واکنش هاي ناهمگن در سطح مشترك سیستمهاي محلول و نامحلول در آب میباشد. تفاوت لیپاز با استرهاي کلاسیک در اینست که سوبستراهاي طبیعی آن در آب نامحلول بوده و فعالیت لیپاز تنها هنگامی حداکثر می شود که آنزیم جذب سطح مشترك روغن-آب شده باشد.[4]
در دهههاي اخیر علاقه به تولید لیپاز میکروبی افزایش یافته است. این آنزیمها به دلیل تطابق ساختار مولکولی و خواص کاتالسیتیشان داراي کاربردهاي بالقوه اي در بخشهاي مختلف صنعتی از قبیل صنایع غذایی، تصفیه فاضلاب، منسوجات، لوازم آرایشی، مواد افزودنی، مواد شیمیایی روغنی، داروسازي، پزشکی، شویندهها، چرم سازي و سوخت که از لیپاز به عنوان کاتالیست به منظور سنتز استرها و همچنین ترانس استریفیکاسیون روغن براي تولید بیودیزل بهره می گیرند، می باشد.همچنین لیپازها می توانند در سنتز پپتید، تولید بیوسورفاکتانت و تجزیه مخلوط هاي راسمیک مورد استفاده قرار گیرند.
علاوه بر اینها یکی از کاربردهاي محتمل لیپاز تجزیه زیستی پلاستیک هایی مانند پلی هیدروکسی آلکانوات - PHA - و پلی کاپرولاکتان - PCL - می باشد.[7-4 ,2]تخمیر حالت جامد - SSF - 2 بعنوان یک فرآیند تخمیري تعریف شده که شامل شبکه جامد بوده و در غیاب و یا در حضور مقادیر بسیار کم آب انجام میشود. سوبسترا بایستی از رطوبت کافی به منظور تأمین رشد و متابولیزم میکروارگانیسم برخوردار باشد.شبکه جامد میتواند منبع مواد مغذي باشد و یا به سادگی تکیهگاهی باشد که توسط مواد مغذياي که به رشد میکروارگانیسمها کمک میکنند، اشباع شده است. پتانسیل فرآیند SSF در جمعآوري میکروارگانیسم کشت داده شده در نزدیکی سوبسترا و رسیدن به بالاترین غلظت سوبسترا براي تخمیر ارزیابی می شود. SSF مشابه محل سکونت طبیعی میکروارگانیسمها بوده و بنابراین انتخاب ارجح آنها به منظور رشد و تولید مواد با ارزش افزوده میباشد.[8]
با وجود مطرح بودن زیاد SSF طی سالهاي اخیر، جنبه طراحی بیوراکتور تاکنون از سوي محققان چندان مورد توجه قرار نگرفته است. به طور معمول بیوراکتورهاي مورد استفاده در SSF را می توان بر مبناي نوع هوادهی و یا مخلوط سیستم بکار گرفته شده به چهار نوع تقسیم بندي کرد: سینی دار، بستر پر شده، سیلندر استوانهاي افقی و بستر سیال. هر کدام از این انواع داراي مزایا و معایب مخصوص به خود میباشند که نیاز به گسترش بیوراکتورهاي جدید با طراحی بهتر را توسعه بخشیدهاند.با وجود آنکه روشهاي افزایش مقیاس در تخمیر غوطهور 3 - SmF - به خوبی گسترش داده شده است، این روشها مستقیماً در مورد بیوراکتورهاي SSF کاربردي نیستند.
به علت تفاوت در ساختار فیزیکی سیستمها، حذف حرارت مسئله اصلی در طراحی بیوراکتورهاي SSF بوده و از زمانهاي دور بعنوان یک عامل محدود کننده در جهت عملی بودن فرایند از نظر تجاري مطرح بوده است.بیوراکتورهاي متعددي در تلاش براي حل این مشکل طراحی شدهاند اما تنها تعداد محدودي از آنها براي طراحی در مقیاس بزرگ مورد استفاده قرار گرفتهاند و اطلاعات راجع به عملکرد آنها به صورت مقالات تحقیقاتی در حال افزایش است,5] .[11-9راکتورهاي سینیدار براساس تخمیر سنتی کوجی4 سادهترین راکتورهاي تخمیر حالت جامد محسوب می شوند. این راکتورها معمولاً شامل سینیهاي کمعمقی به همراه سوبستراهاي تخمیري میباشند که توسط میکروارگانیسمها تلقیح شده و در فضايکنترل شدهاي هوادهی می شوند.
سطح بالایی سینیها در معرض هوا قرار دارد. سطح پایینی معمولاً سوراخ می شود ولی تحت هوادهی اجباري از میان سینیها قرار نمی گیرد.[11] با بهینه کردن شرایط محیطی در داخل بیوراکتور از قبیل درجه حرارت و رطوبت داخلی محفظه میتوان عملکرد فرایند تخمیر حالت جامد را در مقیاس پایلوت و صنعتی تا حد زیادي بهبود بخشید.در این مطالعه، تولید و بهینه سازي آنزیم لیپاز در فرایند تخمیر حالت جامد در یک بیوراکتور سینیدار با استفاده از رایزوپوس اورایزا1 عنوان منبع قارچی مورد بررسی قرار گرفته است. سوبستراي مورد استفاده در این تحقیق تقاله نیشکر میباشد که بعنوان یک منبع ارزان قیمت در شمال ایران قابل یافت است.
-2 مواد و روشها
-1-2 مواد
تمامی موادي که در این تحقیق مورد استفاده قرار گرفتهاند از شرکت مرك آلمان تهیه شدهاند، به جز پارا نیترو فنیل پالمیتات که از شرکت سیگما خریداري شده است. تفاله نیشکر از شرکت دام و طیور واقع در قائمشهر تهیه شده است.
-2-2 میکروارگانیسم و محیط کشت
سویه قارچی رایزوپوس اورایزا بکار رفته در این پروژه به صورت لیوفلیزه شده از کلکسیون قارچ و باکتري ایران - IROST - ،خریداري شد. این سویهي قارچی به مدت 24 ساعت در محیط کشت حاوي آگار کشت داده شد و پس از آن در دماي°C ۴ذخیرهسازي شد. محیط کشت فرایند تخمیر به منظور تولید لیپاز شامل مواد گلوکز، پپتون، سولفات منیزیم هپتا هیدرات، پتاسیم هیدروژن فسفات و عصاره مخمر به ترتیب با ترکیب درصد 10 - g/l - ، 4، 0/2، 1 و 1 بوده است.میکروارگانیسم در یک ارلن مایر 1000 میلیلیتري حاوي محیط کشت رشد داده شد. محیط کشت تلقیح شده به مدت 48
ساعت در انکوباتور شیکر با دماي 30°C و دور 180 rpm نگهداري شد.
-3-2 تخمیر حالت جامد
قبل از استفاده از سوبسترا - تفاله نیشکر - در تخمیر حالت جامد ابتدا آنها توسط آسیاب به صورت ذراتی با اندازهاي در محدوده مطلوب در آمده و سپس سه مرتبه با آب مقطر شستشو داده شدند. بعد از گذشت 24 ساعت و خشک شدن ذرات سوبسترا در دماي محیط، تقاله نیشکر به مدت 20 دقیقه اتوکلاو گردید.برخی از خواص فیزیکی و شیمیایی تفاله نیشکر خریداري شده در جدول 1 آورده شده است:رطوبت و درجه حرارت این محفظه توسط یک کنترولر دیجیتالی دما و یک کنترلر دیجیتالی رطوبت تحت کنترل بوده است. از نمونههاي موجود در سینیها هر روز به طور جداگانه نمونه گرفته شده و میزان فعالیت آنزیم لیپاز به روشی که در ادامه بدان
