بخشی از مقاله
چکیده
آنزیمهای تثبیت شده، مواد زیست فعال مهمی هستند که کاربردهای گستردهای در صنایع شیمیایی، دارویی و بیوتکنولوژی دارند. با این وجود، مکانیسم عمل آنزیم تثبیت شده در واکنشهای مربوطه به درستی درک نشده است. به این منظور بسترهای مختلف اعم از ژلاتین، گرافن و نانوکامپوزیت ژلاتین- گرافن با ترکیب درصدهای 10 و 15 درصد وزنی جهت تثبیت آنزیم لیپاز مورد استفاده قرار گرفت.
هیدرولیز تری گلیسیرید توسط آنزیم لیپاز با تیتراسیون بر حسب زمان مورد مطالعه قرار گرفت. مدل سینتیکی منطبق بر سرعت اولیه واکنش علاوه بر برازش دادههای تجربی بر معادله مکائیلس-منتون با در نظر گرفتن حجم لیپید و غلظت آنزیم بسط و توسعه یافت. منحنی بررسی زمانی واکنش بر حسب مدل بطور مشخص در توافق با داده های تجربی بود. بررسی نتایج دادههای تجربی و تئوری نشان میدهد که فرآیند هیدرولیز طی دو مرحله انجام میگیرد که گاهی اوقات همپوشانی دارند.
-1 مقدمه
هیدرولیز لیپید امولسیون شده توسط لیپازها از نقطه نظر کاربردی از اهمیت بسیار بالایی برخوردار است، زیرا که جایگزین مناسبی برای سنتز اسید های چرب نسبت به روشهای شیمیایی مرسوم است. علاوه بر این، امولسیون های تری گلیسیرید - O/W - محیطی برای بسیاری فرایند مهم و کاربردی کاتالیزوری لیپاز در طبیعت فراهم میکنند، مانند تصفیه فاضلاب با مقدار چربی بالا یا در فرایندهای شستشو، که لیپاز به خوبی لکههای چربی را در دمای پایین حذف میکند.
[2][1] علی رغم این واقعیتها، بیشتر مطالعات در مورد سینتیک فعالیت آنزیم روی سیستمهای همگن انجام شده است. هر چند سیستمهای ناهمگن با استفاده از آنزیم تثبیت شده دارای مزایایی متعددی ازجمله سهولت بازیابی آنزیم است که پارامتر مهم تعیین کننده کاربرد آنزیم در فرایندهای صنعتی است. با این حال مهمترین نقطه ضعف این روش، کاهش فعالیت آنزیم تثبیت شده در مقایسه با نوع آزاد است.
همچنین لازم به ذکر است که اکثر مطالعات سینتیکی هیدورلیز لیپید تا به حال بر سرعت اولیه واکنش متمرکز بوده و اثر بازدارندگی بر فعالیت آنزیم مورد بررسی قرار نگرفته است.[3,4] بنابراین بررسی فعالیت آنزیم تثبیت شده در طول مدت زمان واکنش جهت ارزیابی عملکرد آنزیم در کاربردهای زیستی علاوه بر حصول دیدگاه کامل بر مکانیسم عملکرد لیپید در فرایندهای تصفیه آب و شستشو بسیار حائز اهمیت است.
هرمانش و همکارانش[5] مدل سینتیکی برای هیدرولیز تری گلیسیرید با آنزیم را با مکانیسم پینگ پونگ بی برای یک واکنش سه مرحلهای ارائه دادند. این مدل پیشرفت واکنش در طول زمان را پیش بینی میکند، اما منجر به ثابت سرعت و ثابت جذب بالا میشود که در قیاس با مطالعات پیشین قابل اعتبار نیست. با وجود پیچیدگیهای این مدل، پیشرفت جزئی در برازش دادهها در مقایسه با مدل میکائیلس-منتون - Michaelis-Menten - مشاهده میگردد.
تلاش های زیادی به منظور توسعه روش های آنالیز سینتیکی آنزیم برای تفسیر عامل بازدارنده انجام شده است.[6,7] با این حال، هیچ روش عمومی، مستقیم و عملی برای استخراج پارامترهای آنزیمی از منحنیهای غیر خطی بدست نیآمده است. در تحقیق حاضر مدل سینتیکی برای هیدرولیز لیپید با آنزیم PSSD توسعه یافته است. این مدل جهت بررسی سینتیک هیدولیز لیپید در طی زمان بر پایههای مختلف مورد ارزیابی قرار گرفته است. این مدل سینتیکی جهت پیش گویی رفتار آنزیم تثبیت شده در قیاس با انواع آزاد بسیار کاراست. چندین فرضیه درباره جهتگیری فضایی مولکولهای تری و دی گلیسیرید بر سطح آنزیم بیان شد که نهایتاً با مطالعه نتایج تجربی تایید گردید.
-2 بخش تجربی
-1-2 مواد
در این تحقیق از ژلاتین نوع B با بلوم80-120 1 خریداری شده از شرکت سیگما-آلدریچ2 استفاده شد. گرافیت با درصد خلوص 99/5 و میزان کربن 99/6 از شرکت Graphit Kropfmühl خریداری شد. محلولدیمتیلهیدرازین، اسید سولفوریک، اسید هیدروکلریک، پرمنگنات منیزیم، نیترات سدیم، هیدروکسید سدیم، سولفات پتاسیم، پتاسیم، کلرید منیزیم، کلرید سدیم، تریبوتیرین، Triton X-100، کلرید کلسیم، هیدروکسید سدیم و نمک های بافر فسفات همگی از شرکت های سیگما-آلدریچ و مرک تهیه شد. آنزیم PSSD از شرکت آمانو خریداری شد. برای تمامی فرآیندهای این مطالعه از آب مقطر بدون یون استفاده شد.
-2-2 روش کار
به منظور مطالعه سینتیک آنزیم آزاد و تثبیت شده از روش تیتراسیون بر پایه تنظیم pH استفاده گردید. امولسیون سوبسترا با فراصوتدهی توسط دستگاه فراصوت دهنده Dr Kielscher GmbH حاصل گردید. میزان هضم توسط دستگاه تیتراسیون - Titrando, 800 Dosino 2 mL, software tiamo 2.3, Metrohm 842 - ساخت سوئیس با الکترود پاسخ سریع Unitrode Nr. 6.0259.100 انجام شد. میزان اسید رها شده در طی فرایند هضم توسط تیتراسیون خودکار همراه با افزودن هیدروکسید سدیم اندازه گیری شد. دمای مخلوط واکنش با استفاده از حمام دستگاه ثابت نگه داشته شد. آنزیم لیپاز آزاد یا تثبیت شده به امولسیون پیش حرارت داده شده در محفظه تیتراسیون با سرعت همزدن ثابت اضافه میشود. سپس دادهها با استفاده از معادله سینتیک میکائیلس-منتون برازش گردید.
-3 نتایج و بحث
-1-3 آنالیز و نتایج مربوطه
در این بخش سینتیک هضم لیپید توسط آنزیم لیپاز PSSD به صورت آزاد و تثبیت شده مورد مطالعه قرار گرفت. در شکل مقادیر تجربی حاصل با روش تیتراسیون گزارش شده است. ابتدا بر اساس رابطه میکائیلس-منتون نتایج مورد ارزیابی قرار گرفت - واکنش . - 1 در این رابطه معرف آنزیم، پایه و محصول است.
