بخشی از مقاله
چکیده
بیوسورفکتانت ها ترکیبات میکروبی سطحی فعال هستند و با طیفی از ساختارهای مولکولی متنوع توسط میکروارگانیسم های مختلفی تولید می شوند. جهت گیری ساختار شیمیایی مولکول در سطوح و بین سطوح، طیف وسیعی از خواص مانند توانایی کاهش کشش سطحی و بین سطحی و تشکیل میسل و میکروامولسیون بین فازهای مختلف را به آن اعطا می کند. در این تحقیق از نمونه خاک های آلوده به هیدروکربن در محیط MSM، از انبار روغن بهران اصفهان تعداد 20 جدایه و از تعمیرگاه های ماشین محلی 11 جدایه غربالگری گردید. تست همولیز و گسترش نفت برای جدایه های مخمری انجام گردید.
نتایج تست همولیز در تمام موارد منفی گزارش گردید. با انجام تست گسترش نفت از مجموع 31 جدایه ی مخمری غربال شده از خاک آلوده به هیدروکربن جدایه های SB3 SB4 ,SB8،SB11 ،SB14، SB5 ,SB20 و SB7 دارای توانایی در گسترش نفت بودند. جدایه ی SB7 بالاترین میزان گسترش نفت را نشان داد که با استفاده از روش های بیوشیمیایی به عنوان رودوتورولا موسیلیجینوزا شناسایی گردید. تولید بیوسورفکتانت در محیط نمکی پایه تکمیل شده با روغن گیاهی آفتاب گردان با میزان تولید 16/9 گرم بر لیتر توسط رودوتورولا موسیلیجینوزا برای اولین بار در جهان در این مطالعه گزارش گردید.
کلمات کلیدی: بیوسورفکتانت، رودوتورولا موسیلیجینوزا، گسترش نفت، مخمر، به هیدروکربن
مقدمه و هدف
برخی از میکروارگانیسم ها از جمله باکتری، مخمر و قارچ ها قادر به تولید طیف گسترده ای از ترکیبات آمفی فیلیک، با دو بخش آبدوست و آبگریز درون مولکول هستند که اجازه می دهد آنها قادر به کاهش کشش سطحی باشند. این ترکیبات فعال سطحی که بیوسورفکتانت یا بیوامولسیفایر نامیده می شوند نسبت به سورفکتانت های با منشا شیمیایی قابلیت تجزیه بیولوژیک، سازگاری با محیط زیست، سمیت کم و فعالیت های خاص در دماهای بسیار بالا، pH و شوری را دارا هستند. بیوسورفکتانت ها می توانند جایگزین بالقوه برای سورفکتانت های مصنوعی باشند و انتظار می رود که با توجه به خواص دترجنتی، ایجاد امولسیون، پراکندگی و حل کنندگی ترکیبات آبگریز در برنامه های مختلف صنعتی و زیست محیطی از آنها استفاده شود. اغلب سورفکتانت هایی که در حال حاضر تولید می شوند مبتنی بر نفت هستند و یا از مواد شیمیایی سنتز می شوند. استفاده از این ترکیبات اغلب سمی، منجر به مشکلات زیست محیطی قابل توجهی می شود. در این پژوهش سعی بر تولید بیوسورفکتانت از جدایه های مخمر بومی گردیده است - . - 6
مواد و روش ها نمونه گیری از خاک و پساب آلوده به هیدروکربن
نمونه برداری از چندین قسمت از انبار روغن بهران اصفهان انجام گرفت و نمونه ها در کمتر از دو ساعت به آزمایشگاه منتقل شدند. می توان به این نکته اشاره کرد که این انبار دارای آلودگی طولانی بیش از 20 سال با هیدروکربن بود. نمونه خاک های آلوده به هیدروکربن به صورت همگن مخلوط شدند و با استفاده از الک استریل با منافذی با قطر 2 میلی متر سنگ ریزه ها از آن حذف گردید. با استفاده از قاشقک استریل از هر نمونه خاک الک شده 10 گرم به 90 میلی لیتر محیط MSM اضافه شد و در دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 5 روز در شیکر با دور 200rpm قرار داده شدند. کلرامفنیکل % 0/05 نیز به محیط افزوده شد تا از رشد باکتری ها جلوگیری شود. پس از طی زمان انکوباسیون از این محیط 2 میلی لیتر به ارلن دیگری حاوی محیط MSM جدید اضافه شده و این کار سه بار در شرایط ذکر شده تکرار شد. سپس از محتویات آن روی محیط YPG آگار کشت خطی داده شد و تک کلونی های خالص به دست آمد - . - 9
تست همولیز
هر یک از جدایه ها روی پلیت آگار خون دار کشت خطی داده شدند و به مدت 48-72 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد. پلیت ها از نظر ایجاد همولیز مورد بررسی قرار گرفته شد. قطر مناطق روشن به غلظت بیوسورفکتانت بستگی دارد. جدایه های بدون همولیز - - - ، همولیز ناقص - - +1، همولیز کامل با قطر لیز 1 < سانتی متر - +2 - ، همولیز کامل با قطر لیز1 > سانتی متر اما 3 < سانتی متر - - +3 و همولیز کامل با قطر لیز3 > سانتی متر - +4 - در نظر گرفته شدند . - 10 -
تست گسترش نفت
در یک پلیت 25 سانتی متری، 50 میلی لیتر آب افزوده و به آن 20 میلی لیتر نفت خام اضافه شد. به صورتی که نفت به شکل یک لایه ی نازک در سطح آب قرار گرفت. 10 میکرولیتر از سوسپانسیون محیط کشت به آن اضافه گردید. گسترش نفت نمایان گر تولید بیوسورفکتانت در نظر گرفته شد . - 8 - تولید سوفورولیپید در محیط نمکی پایه تکمیل شده با روغن گیاهی یک لوپ از کلونی جدایه های مخمری که غربال شده بودند به ارلن های 250 میلی لیتری حاوی 100 میلی لیتر محیط MSM با pH= 5 اضافه شد و در دمای 30 درجه سانتیگراد و سرعت هوادهی 200rpm به مدت 24-48 ساعت انکوبه شدند. پس از طی زمان انکوباسیون 5 میلی لیتر از این محیط به ارلن های حاوی محیط کشت نمکی پایه تکمیل شده با %10 روغن آفتاب گردان با pH= 5 تلقیح گردید و با سرعت هوادهی 200rpm در دمای 28 درجه سانتی گراد و به مدت 11 روز انکوبه گردید - 7،. - 3
استخراج بیوسورفکتانت سوفورولیپید
پس از طی زمان انکوباسیون به اندازه دو برابر حجم محیط کشت، اتیل استات به محیط کشت مایع تولید پس از طی زمان انکوباسیون اضافه شد و سپس به مدت نیم ساعت در شیکر قرار داده شد. پس از آن اتیل استات توسط تبخیر در خلأ در 50 درجه سانتی گراد حذف گردید. این عمل سه بار تکرار گردید. برای حذف اسید چرب باقی مانده سه بار شستشو با ان هگزان انجام شد. برای حذف بیومس سلولی با سرعت 8000rpm به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ انجام شد. آنچه باقی ماند بیوسورفکتانت خام بود که در دمای 50 درجه سانتیگراد در فور به مدت 24 ساعت خشک شد. وزن خشک بیوماس از تفریق وزن لوله ی خالی از لوله های حاوی بیوماس که سه بار با اتیل استات و هگزان شستشو شده اند و در دمای 50 درجه سانتیگراد به مدت یک شبانه روز خشک گردیده بودند محاسبه شد. تمام آزمایشات با سه مرتبه تکرار انجام گردید و نتایج به صورت متوسط بیان شد 1 - ، . - 5
بررسی اثر دما و pH
تاثیر دمای - 25-35 - درجه سانتی گراد و - 9- 2 - pH بر میزان تولید بیوسورفکتانت بررسی شد.
نتایج و بحث
