بخشی از مقاله
چکیده:
تولوئن با فرمول شیمیایی C7H8 یا C6H5-CH3 و با اسامی مترادف فنیل متان و متیل بنزن، مایع شفاف و بی رنگ بوده و در گروه هیدروکربن های آروماتیک با سرگروهی بنزن قرار دارد. نمونه برداری از خاک های آلوده به نفت اطراف پالایشگاه تهران صورت گرفت. جداسازی باکتری های تجزیه کننده ی تولوئن به وسیله ی کشت نمونه ها در محیط پایه ی نمکی نوترین براث و MSMآگار انجام شد. با کشت باکتری های ایزوله در غلظت های 0/1، /2، 0/3، و0/4 گرم برلیتر تولوئن توانایی رشد باکتری ها ارزیابی گردید. مهمترین باکتری های تجزیه کننده ی فرمالدئید جدا شده از خاک های آلوده به نفت پالایشگاه تهران باسیلوس لیکنی فورمیس ، سودوموناس استودزری، سودوموناس sp، باسیلوس sp، آکروباکتریوم کا تی بودند.همه ی باکتری های جدا شده قدرت تجزیه ی بالایی در حذف فرمالدئید از خود نشان دادند. یکی از بهترین و کم هزینه ترین روشهای تجزیه آلاینده های محیطی می باشد.چنین استنباط می شود که باکتری های تجزیه شده توانایی تحمل و رشد در حضور تولوئن را دارا هستند و میزان تجزیه باکتری های منفی نسبت به مثبت بیشتر است و در حداقل غلظت مهارکنندگی سودوموناس رتبه اول و باسیلوس رتبه دوم را به خود اختصاص دادند و حداقل غلظت مهارکنندگی باکتری ها به ترتیب 4,6 مول بر لیتر و 4,2 مول بر لیتر است.در کل میتوان گفت که تنوع باکتری ها ی جداسازی شده از خاک اطراف پالایشگاه تهران و همچنین کارایی تجزیه کنندگان از نظر زیستی بالا می باشد.
واژگان کلیدی: تولوئن، تجزیهی زیستی، سودوموناس، فلاووباکتریوم، پالایشگاه تهران،
مقدمه:
تولوئن با فرمول شیمیایی C7H8 یا C6H5-CH3 و با ا سامی مترادف فنیل متان و متیل بنزن، مایع شفاف و بی رنگ بوده و در گروه هیدروکربن های آروماتیک با ســرگروهی بنزن قرار دارد.با جایگزین نمودن یک گروه متیل به یکی از هیدروژنهای بنزن میتوان تولوئن را تولید نمود. تولوئن به عنوان یک ماده شیمیایی حدوا سط و حلال، در صنعت از اهمیت فوق العاده ای برخوردار است .(Anita and Wilfried , 2006) و در صنایع نظامی برای ساخت تی ان تی یا تری نیترو تولوئن و در صنایع شیمیایی به عنوان حلال در ساخت رنگ، براق کننده های رنگ، لاک ناخن، لاک الکل، چسب پلاستیک، لاستیک، مواد چاپ کننده و چرم مصــنوعی اســتفاده می شــود(.(Hajimiragha 1989 نکته جالب اینکه تولوئن به عنوان داروی استنشاقی برای دفع سموم نیز می باشد.
تاکنون راههای متفاوتی مانند روش های شیمیایی، مکانیکی (فیزیکی)و بیولوژیکی(پاک سازی زی ستی) به منظور پاک سازی ترکیبات PAH و سایر آلاینده ها از محیط به کار گرفته شده است. دو روش اول علاوه بر هزینه بر بودن، آلاینده را بطور کامل تخریب نمی کنند و موجب انتقال آلودگی از محیطی به محیط دیگر می گردند(.(Haritash and Kaushik ,2009 زیست پالایی فرآیندی است که کمترین مقدار انرژی، ماده شیمیایی و زمان را لازم دارد و موجب تغییر شکل آلاینده از فرم خطرناک به فرم کم خطر یا بی خطر می گردد(.(Niel , 1995
روشهای زیستی دارای مزایایی نسبت به روشهای فیزیکی و شیمیایی در حذف نشت نفت هستند بطوریکه آنها تجزیه زیستی درونی بخش های نفت به وسیله میکروارگانیسمها را میسر میسازند(.(Luis et al., 2000 and Vinaset al., 2002روش پاکسازی زیستی نسبت به سایر روش های پاک سازی مواد زائد خطرناک، ارزان تر و ایمن تر هستند و به جای انتقال آلاینده ها از محیطی به محیط دیگر، تخریب کامل آلاینده امکانپذیر می باشد(Evans.(Arunet al., 2011وهمکارانش در سال 1991 در مطالعهای که بر روی تجزیه بیهوازی تولوئن توسط باکتریهای دنیتریفیکاسیون انجام دادند، باکتری دنیتریفیکه کننده سوش T1را با روشهای مولکولی شناسایی کردند که قادر بود از تولوئن به عنوان تنها منبع کربن استفاده کرده و بیش از 50 درصد کربن تولوئن را به CO2 تبدیل کند(.(Evans, 1991et alدر زمینه پاکسازی زیستی, شیلدز وهمکاران (1991) لی و همکاران , (1995) لی و گیبسون (1996)، طی پژوهشهای خود تاثیر مثبت حضور باکتری سودوموناس را در زدودن آلاینده های آلی گزارش کرده اند. Munro
و Lindsay با مطالعه ای که بر روی باکتریBacterium EX-DG74 در سال 1996 انجام دادند نشان دادند که توانایی بالای این سویه در پاکسازی زیستی آلاینده های مختلف علاوه بر وجود آنزیمهای پراکسیدازی به علت فعالیت سیتوکروم P450
است. این پروتئین با فعالیت اکسیژنازی خود از عوامل مهم در تجزیه حلالهایی مانند تولوئن و سورفکتانتهایی نظیر اسید اولئیک و غیره محسوب میشود(.(Munro and Lindsay 1996
روش انجام آزمایش:
معرفی مکان نمونه برداری
پالایشگاه تهران
شرکت پالایش نفت شهید تندگویان تهران در 15 کیلومتری جنوب تهران (کیلومتر 7 شهر ری در نزدیکی نیروگاه گازی ری)واقع گردیده و یکی از قدیمیترین پالایشگاههایفعّال ایران است که در سال 1344 باظرفیّت 85 هزار بشکه در روز راه اندازی شد.این پالایشگاه مشتمل بر دو پالایشگاه جنوبی (شماره (1 و شمالی(شماره (2 است.(شکل(1
شکل -1 موقعیت جغرافیایی پاﻻیشگاه تهران(( https://earth.google.com
روش غنی سازی باکتری های مقاوم به تولوئن:
برای غنی سازی باکتری های مقاوم به تولوئن به منظور افزایش جمعیت میکروبی سازگار با این منبع هیدروکربنی 10 گرم از خاک هر ایستگاه که حاوی انواع باکتری های سازگار با محیط نفتی بود با 90 میلی لیتر محیط کشت معدنی مایع MSM مخلوط شد سپس این محیط پایه نمکی که محتوی خاک و ترکیب تولوئن بود به مدت یک هفته در دمای 28 درجه سانتی گراد با هوا دهی در گرم خانه شیکردار قرار داده شد.
روش جداسازی و خالص سازی باکتری های مقاوم به تولوئن
پس از گرمخانه گذاری 1میلی لیتر از محیط های مایع نمک معدنی به محیط های جامد نمک معدنی حاوی تولوئن منتقل و
با گلس اسپیدر سواب کشت داده شد. پلیت های حاوی محیط کشت به مدت 48 ساعت در دمای 30 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری
شد.
کلونی هایی که از نظر ریخت شناسی با هم متفاوت بودند به منظور خالص سازی روی بلاد آگار کشت داده شدند. کشت
روی بلادآگار تا زمان خالص سازی کامل همه سویه ها تکرار گردید(.(Abd – elsalamet al., 2009
غربالگری سویه های برتر
افزایش مرحله به مرحله غلظت تولوئن به منظور سازگاری سویه های تحمل کننده در غلظت های بالاتر و جداسازی سویه های برتر با تلقیح جدایه ها به محیط کشت پایه معدنی همراه با سوبسترای مورد نظر (تولوئن) در محدوده غلظت های 0/09Mol/L، 1/86، 2/3، 2/80، 3/26، 3/73، 4/2، 4/67 صورت گرفت. پس انجام غربالگری، سویه هایی که بیشترین میزان تحمل نسبت به تولوئن را از خود نشان دادند انتخاب گردیدند
تست حداقل غلظت مهارکنندگی (MIC)
به منظور تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی تولوئن توسط باکتریهای بدست آمده ابتدا به تعداد هر باکتری 8 لوله حاوی LB-
Brothو غلظت های مختلف تولوئن 2/3Mol/L، 2/80، 3/26، 3/73، 4/2، 6/0، 5/60، 5/13، 4/67 تهیه شد. سپس از هر یک
از باکتری ها و همچنین مخلوطی از آنها سوسپانسیون باکتریایی مطابق با استاندارد نیم مک فارلند تهیه گردید.
1 میلیتر از سوسپانسیون میکروبی به 1 میلی لیتر از هر کدام از لوله ها ی حاوی تولوئن و LB- Broth تلقیح شد و سپس
به مدت 24 ساعت در 28 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری شد. این کار برای تمامی باکتری های بدست آمده در مرحله قبل انجام
گردید. در ضمن یک لوله به عنوان شاهد در نظر گرفته شد که فقط LB- Broth و باکتری مورد نظر درآن ریخته شد. در نهایت کدورت هر یک از لوله ها بررسی و حداقل غلظت بازدارندگی تعیین گردید. کمترین غلظتی)اولین لوله (که در آن رشد دیده نشد به عنوان MIC گزارش شد.
مطالعه سینتیک رشد باکتری های تجزیه کننده تولوئن
به منظور ارزیابی رشد باکتری های جدا شده، به تعداد باکتریها و همچنین مخلوطی از آنها محیط کشت پایه نمکی به میزان 90 میلی لیتر در ارلن تهیه گردید و غلظت های مختلف از تولوئن( Mol/L، 2,8، 3,2، 3,7، ( 4, 2 به آن اضافه گردید. سپس سوسپانسیون باکتری برطبق استاندارد نیم مک فارلند تهیه شده و از آن به نسبت 1 به 10 به هر کدام از ارلن ها اضافه گردید. برای هر کدام از باکتری ها 4 ارلن در نظر گرفته شده و در هر ارلن تولوئن اضافه گردید. همچنین برای هر باکتری یک ارلن به عنوان شاهد در نظر گرفته شد در محیط شاهد فقط محیط کشت پایه بدون ترکیب نفتی تولوئن با سویه مشخص وجود داشت و یک ارلن هم شامل میکس باکتریها و تولوئن بود.محیط ها در دمای 30 درجه سانتی گراد گرمخانه گذاری شد و در نهایت اندازه گیری جذب در 600 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل(Milton Roy به صورت روزانه قرائت و یادداشت گردید این کار تا هفت روز پس از تلقیح انجام شد.
روش انجام آنالیز آماری
آنالیز آماری نتایج به دست آمده از میزان رشد جدایه های برتر در غلظت های مختلف با استفاده از نرمافزار spssانجام شد. نتایج آزمایش:
جداسازی و خالص سازی
در مرحله جداسازی جدایه های متفاوت بر اساس خصوصیات ریخت شناسی، رنگ و شکل ونوع کلنی ها روی محیط جامد نمک معدنی و بلاد آگار و با استفاده از میکروسکوپ(مدل (OLYMPUS، جداسازی و خالص سازی شدند. در این مرحله 23
باکتری به عنوان باکتری های بومی مقاوم به تولوئن جداسازی شدند.
غربالگری و انتخاب جدایه های برتر
در پایان این مرحله، سویه های برتر که شامل 5سویه مقاوم به تولوئن بودند انتخاب گردیدند. این سویه ها بیشترین میزان تحمل را نسبت به تولوئن از خود نشان دادند. جدایه های برتر تا غلظت 45درصد تولوئن تحمل را نشان دادند و برای انجام مراحل بعدی انتخاب گردیدند.
MIC سویه های مقاوم به تولوئن
در این مرحله میزان تحمل جدایه های برتر نسبت به غلظت های متفاوت تولوئن با انجام آزمایش MIC برای اندازه گیری مقدار حداقل غلظت بازدارندگی بررسی شد.
بر طبق نتایج حاصل(جدول (1 سویه های باسیلوس لیکنی فورمیس و آکروباکتریوم بیشترین میزان 4/6MIC مول بر لیتر) و سویه سودوموناس(3/2)1 نیز کمترین میزان MIC را نشان دادند.
جدول -1 نتایج MIC سویه های مقاوم
سویه ها غلظت MIC(mol/l)
باسیلوس لیکنی فورمیس 4/6
سودوموناس استودزری 4/2
سودوموناس sp 4/2
باسیلوس sp 4/2
آکروباکتریوم کا تی 51 4/6
کینتیک رشد
نتــایج بــه دســــت آمــده از میزان رشــــد جــدایــههــای برتر و مخلوط بــاکتریــایی در دمــای 30 درجــه و غلظت های 2,8 مول بر لیتر، 3,2 مول بر لیتر، 3/7 مول بر لیتر،4,2 مول بر لیتر تولوئن نمودارهای (1-4) تا (6-4) بیان شــده است.
