مقاله جداسازی باکتری های نفت‌خوار از خاک‌های آلوده پالایشگاه و پتروشیمی تبریز و ارزیابی کارایی تجزیه نفتی آنها

بخشی از مقاله

چکیده

هیدروکربنهای نفتی از عمدهترین آلایندههای آلی در اکوسیستمهای آبی و خاکی در سراسر دنیا محسوب میشوند. یکی از راههای ارزان و مقرون به صرفه، استفاده از ریزجانداران برای حذف یا کاهش آلودگی نفتی است. در این مقاله به نحوه جداسازی و ارزیابی کارایی این باکتریها از مکانهای آلوده پالایشگاه و پتروشیمی تبریز پرداخته شده است. از میان 60 جدایه جداسازی شده ، 20 جدایه کارای تجزیه نفت خام با استفاده از روشهای مختلف کمی و کیفی شناسایی شدند. کاراترین جدایهها که هم دارایOD، بیومس میکروبی و درصد تجزیه نفتی بالایی بودند و هم به تستهای تولید بیوسورفاکتانت پاسخ مثبت دادند شامل10 جدایه CD2-1، CD1-5، CD4-3، CD4-2، CD9-3، CD6-3، CD7-1، CD3-1، CD1-1 و CD8-1 بودند. دیگر جدایههای کارای تجزیه نفتی که دارایOD، بیومس میکروبی و درصد تجزیه نفتی بالایی بودند ولی توانایی تولید بیوسورفاکتانت نداشتندشامل 10 جدایه CD1-4، CD5-6، CD4-5، CD7-3، CD4-6، CD6-1، CD6-4، CD2-3، CD8-2 و CD3-3 شدند.

واژههای کلیدی: باکتریهای نفتخوار، خاک آلوده به نفت، جداسازی، بیوسورفاکتانت

مقدمه

آلودگی خاک با نفت خام و مشتقات آن از جمله خطرناکترین انواع آلودگیهای زیست محیطی محسوب میگردد. رشد روزافزون صنعت نفت و صنایع جانبی در ایران، هیدروکربنهای نفتی را جزء اولین آلایندههای محیطی به خصوص در مناطق جنوبی کشور و اطراف پالایشگاهها، صنایع پتروشیمی و نیروگاههای کلانشهرهای ایران قرار داده است - رجایی و همکاران، . - 1391 آبگریزینسبتاً بالای هیدروکربنهای نفتی موجب افزایش چشمگیر قابلیت تجمع آنها در خاک شده و منجر به کاهش دسترسی زیستی این آلایندهها جهت حذف زیستی میگردد؛ لذا میبایست راهکارهای مناسبی جهت حذف یا کنترل آلایندههای نفتی در خاک اتخاذ شود.

در سه دهه اخیر روشهای فیزیکی، شیمیایی و بیولوژیکی مختلفی نظیر تصفیه حرارتی، تثبیت و جامدسازی و زیستپالایی یا زیستسالمسازی، جهت رفع آلودگی از خاک معرفی و مورد استفاده قرار گرفتهاند. روش-های فیزیکی و شیمیایی جهت حذف آلودگی از مناطق با وسعتنسبتاً کم کاربرد دارند و برای آلودگیهای در سطح وسیع بسیار پرهزینه هستند . - De la Fuente et al., 2011 - با بیان مشکلات ذکر شده و توجه به اصل حفظ بهداشت و سلامت جامعه و نیز اصل توجه به سلامت خاکها در تولید بهینه محصولات کشاورزی، لزوم پاکسازی محیط زیست از آلایندههایی مثل پلیهیدروکربنهای نفتی به وضوح قابل درک است. زیستپالایی یکی از روشهایی است که میتواند در حذف یا کاهش آلودگیهای نفتی بکار رود و برخلاف برخی از روش-های گذرا و موقتی، این روش در بعضی شرایط راهحل دائمی محسوب میگردد . - Agamuthu et al, 2013 -

از آنجائیکه خاک پالاینده طبیعی محسوب میشود که این ویژگی را مرهون خواص فیزیکی، شیمیایی و بیولوژیکی خود است، بسیاری از میکروارگانیسمهای موجود در خاک قادرند از ترکیبات نفتی به عنوان منبع کربن و انرژی استفاده کنند و آنها را به موادی از قبیل H2O و CO2 تبدیل نمایند . - Yu et al., 2011 - جداسازی این میکروارگانیسمها از محیطهای آلوده نفتی و ارزیابی کارایی آنها در تجزیه نفت و تکثیر و بکارگیری آنها بهصورت کنسرسیوم باکتریایی از مراحل ابتدایی زیستپالایی میباشد - Meenu . - Tyagi, 2010 در این پژوهش سعی بر آن شده است که از مکانهای آلوده پالایشگاه و پتروشیمی تبریز، باکتریهای نفتخوار یا تجزیهکننده ترکیبات نفتی بومی جداسازی شده و با استفاده از انواع تستهای کمی و کیفی و مقایسه آنها بهترین و کاراترین باکتریها برای رفع آلودگی این خاکها برای روش زیست پالایی معرفی گردد.

مواد و روشها

نمونهبرداری از خاکهای آلوده به مواد نفتی و جداسازی باکتریهای نفتخوارنمونه برداری از 9 مکان آلوده به نفت در پالایشگاه و پتروشیمی تبریز انجام شد. برای جداسازی باکتریهای تجزیهکننده ترکیبات نفتی ابتدا اقدام به غنیسازی میکروبی شد. برای غنیسازی، از محیط کشت حداقل MSM عاری از منابع کربن با کمی تغییرات استفاده شد. محیط کشت MSM استفاده شده شامل؛ NH4Cl 2g، KH2 PO4 5g، Na 2HPO4 4g، 0. 2 gMnSO4، MgSO4 0.2 g، FeCl3 0.05g، ، CaCl2 0.001g، CoCl2 0.001g، - NH4 - 6Mo7O2 0.0001g در لیتر با تنظیم pH7/2 بود . - Maiti and Bhattacharyya, 2012 - بدین ترتیب 10 گرم از نمونه خاک آلوده به 100 میلیلیتر محیط MSM استریل حاوی %3 نفت خام افزوده شد و به مدت1 هفته در دمای 26 C و شیک 120 rpm قرار گرفت. همچنین 10 گرم از نمونه خاک بدون افزودن نفت خام در محیط MSM نیز به عنوان شاهد لحاظ شد.

بعد از گذشت یک هفته، یک زیرکشت تهیه شد؛ بدین صورت که 2ml از این محیط کشت به 100 میلیلیتر محیط MSM استریل تازه حاوی % 3 نفت خام اضافه شد ومجدداً به مدت یک هفته دیگر در شرایط فوق قرار گرفت. پس از گذشت زمان و مشاهده کدورت کافی در ارلنها و علائم رشد باکتری در مقایسه با ارلن شاهد، اقدام به تهیه سری رقت شده و سپس از رقتهای 10-4، 10-5 و 10- 6 تهیه شده مقدار 100 میکرولیتر برداشته و به محیط کشت MSM جامد حاوی 2 درصد نفت خام اضافه و با میله شیشهای پخش شد. بعد از ظهور کلنیها در سطح پلیت - مطابق شکل - 4، کلنیهای منتخب به محیط نوترینت آگار انتقال داده شدند و پس از اطمینان از خلوص کلنیها - با انجام زیرکشتهای متوالی - اقدام به تهیه استوک جدایهها در گلیسرول %15 شد.

ارزیابی کارائی تجزیه ترکیبات نفتی

برای بررسی کارائی تجزیه ترکیبات نفتی، ابتدا از جدایهها در 10 ml محیط کشت نوترینت براث کشت شبانه داده شد و پس از سانتریفیوژ روشناور آنها دور ریخته شد و رسوب باکتری با با سرم فیزیولوزیک %0/9 شستشو شد و سپس رسوب باکتری در 3 میلیلیتر از سرم معلق شد و 1 ml از آن برای تلقیح در ارلنهای 100 میلیلیتری حاوی 30 میلی لیتر محیط کشت MSM استریل با %2 نفت خام افزوده شد. ارلنها به مدت 9 روز در دمای 26 C و 120 rpm شیک شدند. این آزمایش برای هر جدایه در 3 تکرار و با حضور ارلن شاهد بدون تلقیح باکتری انجام گرفت. بعد از گذشت 9 روز آزمایشات زیر شامل - قرائت چگالی نوری، توزین بیوماس میکروبی، تعیین درصد تجزیه نفت خام و تستهای تولید بیوسورفاکتانت - انجام گرفت.

اندازهگیری کدورت محیط کشت باکتریها

بعد از 9 روز و کدر شدن محیطهای کشت، 3 میلی لیتر از محیط کشتها پس از هم زدن به داخل کوت اسپکتروفتومتر ریخته شد و چگالی نوری آنها در طول موج 600 nm قرائت شد. لازم به ذکر است که بعد از قرائت اولیه OD و به دست آمدن اعداد بیش از یک، ابتدا نمونهها رقیق شده و نتایج پس از تصحیح اثر رقت گزارش شده است. این روش بر آن بنا نهاده شده است که باکتریهای که از ترکیبات نفتی بهتر استفاده میکنند قادر به تولید و تکثیر بیشتری بوده و ضمن افزایش بیوماس میکروبی باعث کدورت محیط خواهند شد . - Maiti and Bhattacharyya, 2012 -

اندازهگیری بیومس میکروبی

حجم مناسبی از محیط کشتها به درون ویالهای 2 میلیلیتری ریخته شد، سپس در دور 13000سانتریفیوژ شدند و روشناور به دور ریخته شد و وزن پلت باکتری بعد از خشک شدن درون آون در دمای 50 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت،وزن شد . - Chandankerea et al, 2013 -

درصد تجزیه نفت خام

برای محاسبه میزان نفت تجزیه شده از رابطه - 1 - استفاده شد . - Ibrahim et al., 2013 - برای این کار ابتدا به باقیمانده محیط کشت، 15ml دیاتیلاتر اضافه شد، پس از همزدن محیط، به داخل قیف جداکننده استوانهای ریخته شد و بدین ترتیب نفت خام حل شده در دیاتیلاتر از محیط کشت باکتری جدا شد؛ سپس نفت خام و دی اتیل اتر جدا شده در لوله های آزمایش از قبل وزن شده ریخته شده و در بن ماری در 36 درجه سانتیگراد قرار داده شد. پس از تبخیر کامل دیاتیلاتر، مقادیر نفت خام باقیمانده برای نمونه شاهد و جدایههای باکتریایی توزین شد.B درصد تجزیه زیستی، W1 وزن نفت باقیمانده در نمونه شاهد و WC وزن نفت باقیمانده در جدایهها میباشد.تستهای تولید بیوسورفاکتانت فعالیت گستردگی روغن1این آزمایش با اضافه کردن 50 ml آب مقطر در داخل پتریدیش و اضافه کردن 100 ʽl نفت خام به سطح آب انجام گرفت.

سپس 10 ʽl از روشناور حاصل از محیطهای کشت بر روی لایه نفتی ایجاد شده، ریخته شد . - Ibrahim et al, 2013 - قطر قطره حاصله عاری از نفت اندازهگیری شد. در این آزمایش دو شاهد SDS به عنوان کنترل + و آب مقطر به عنوان کنترل - استفاده شد.تست همولیزه شدن بر روی بلاد آگار2به مقدار 10 ʽl از محیطهای کشت جدایههای باکتری برداشته شد و بر روی بلاد آگار حاوی - v/v - % 5 خون گوسفندی در پلیتها به صورت نقطهای در سه تکرار کشت داده شد و در 26°c داخل انکوباتور به مدت 5 روز نگهداری شدند - Ibrahim et . - al., 2013 فعالیت همولیزی بلاد آگار با ایجاد یک هاله شفاف به دور کلنیها ظاهر میشود که نشاندهنده تولید بیوسورفاکتانت از آن جدایهها میباشد - شکل . - 4

تست CTAB3 متیلن بلو آگار

برای انجام ایت تست از محیطهای کشت هر جدایه باکتری به مقدار 10 ʽl برداشته شد و بر روی CTAB متیلن بلو آگار - حاوی CTAB 0/2 mg/ml و 0/005 ʽg/ml متیلن بلو در نوترینت آگار - در پلیتها به صورت نقطهای در سه تکرار کشت داده شد و در 26°c داخل انکوباتور به مدت 5 روز نگهداری شدند CTAB . - Chandankerea et al, 2013 - یک دترجنت کاتیونی میباشد. بنابراین ایجاد یک هاله آبی تیره به دور کلنیها در محیط کشت CTAB متیلن بلو آگار - که رنگ پایه آن آبی روشن میباشد - نشان دهنده تولید بیوسورفاکتانت آنیونی از طرف جدایهها میباشد - شکل . - 4بعد از انجام آزمایشهای فوق کارآمدترین جدایهها برای شناسایی مولکولی معرفی خواهند شد و استفاده از آنها در تیمارهای زیستپالایی صورت خواهد گرفت.

نتایج و بحث

بعد از رشد کامل باکتریها و کلنیها در پلیتها در مرحله اول آزمایش 60 جدایه جداسازی شد که با توجه به نوع گرم، ریخت و شکل، رنگدانه و الگوی رشد، کلنیهای مشابه حذف شده و 44 جدایه متفاوت از لحاظ مورفولوژی نگهداری و استوک آنها تهیه شد.

کدورت سنجی باکتریها OD600 - باکتریها -

از بین 44 جدایه باکتریایی 8 جدایه دارای OD بالایی بودند، جدایههای CD4-34 و CD4-2 - به ترتیب 12/18 و - 10/45 بیشترین کدورت را داشته و اختلاف معنیداری بین آنها مشاهده نشد. جدایههای CD9-3، CD4-6 و CD1-4 هر سه به