بخشی از مقاله
چکیده
هدف از این پژوهش شناسایی مخمرهاي ایزوله شده از مواد غذایی بود. ابتدا مخمرها توسط روشهاي مورفولوژي کلنی جداسازي شدند سپس براي شناسایی دقیق با جفت آغازگرهاي عمومی قارچها، ناحیه 26S rRNA تکثیر داده شد. قطعات تکثیرشده پس از خالصسازي به منظور توالییابی به شرکت بیوساینس رجستد انگلستان ارسال شدند. سپس با مقایسه توالیهاي حاصل با توالیهاي موجود در بانک ژن - NCBI - ، گونه مخمرهاي مورد مطالعه مورد شناسایی قرار گرفتند. نتایج حاصل نشان داد مخمرهاي ایزوله شده ساکارومایسس سرویزیه ، ساکارومایسس اگزیگوس، ایساتچنیکا اورنتالیس، تورولوسپورا فرانسیسکا، تورولوسپورا دلبروکی و پیشیا فرمنتاس بودند که گونههاي غالب مربوط به ساکارومایسس سرویزیه و ساکارومایسس اگزیگوس بودند.
-1 مقدمه
امروزه ابزارهاي جدیدي براي طبقهبندي و شناسایی باکتريهاي و کپکها در حال جایگزین شدن هستند که روشهاي قدیمی که بر پایه فنوتیپ بودند را تکمیل میسازند. براي کاربردهاي روزمره، مطمئنترین روش، توالی یابی ژن 16S rRNA و 26SrRNA بر پایهي PCR و الگوهاي پروتئین محلول است. براي تعیین موقعیت فیلوژنیک گونهها و جنسها، RNA ریبوزومی - - rRNA مناسبتر است؛ زیرا این توالی هم داراي نواحی کاملا حفظ شده و هم نواحی کمتر حفاظت شده میباشد. در حال حاضر، تعیین توالی rRNA باکتريها کار نسبتا آسانی است. تاکسونومی کنونی تا میزان زیادي بر اساس روابط فیلوژنیک استوار است که براساس کار توالیهاي ژنتیکی حاصل شده است
در گذشته براي تعیین توالی این ژن از روش نسخهبرداري معکوس استفاده میشد - لان و همکاران، - 1985 اما امروزه تعیین توالی این ژنها، با استفاده از واکنش زنجیرهاي پلیمراز - PCR - صورت میگیرد - سایکی و همکاران، . - 1988 مقایسه این توالیها، قدرتمندترین و صحیحترین تکنیک را براي تعیین روابط فیلوژنیک میکروارگانیسمها فراهم میآورد - ووز،. - 1987 یکی از مزایاي مهم این روش، شناسایی و توصیف دقیق جنسهاي جدید میباشد
ترکیب مخمرها و اسید لاکتیک باکترها اغلب بهصورت تصادفی در تولید نوشیدنیها و غذاهاي تخمیري است. که بیشترین ترکیب متداول کاندیدا مایلري و لاکتوباسیلوس سانفرانسیس در خمیر ترش سانفرانسیسکو است - کلاین و سوگی هارا، . - 1971 بر هم کنش این دو میکروارگانیسم بر پایه این اصل است که لاکتوباسیلوس سانفرانسیس مالتوز را تخمیر میکند و گلوکز را در اختیار مخمر که از مصرف مالتوز عاجز است قرار میدهد بنابراین pH کم خمیرترش تاثیر کمتري روي رشد کاندیدا میلري دارد
هدف از این پژوهش شناسایی مخمرهاي ایزوله شده از مواد غذایی جمع آوري شده از مناطق مختلف گرگان بود.
-2 مواد و روش
-1-2 مواد
Y.G.C آگار، YM براث، TBE بافر، کلروفرم ،اتانول و مسترمیکس
-2-2 آمادهسازي نمونههاي مورد آزمایش
نمونههاي مواد غذایی - آب انگور، خمیر ترش و سرکه - از مناطق مختلف شهر گرگان جمع آوري شدند. سپس طی دو مرحله و در شرایط استریل فعال سازي شدند. بدین منظور نمونههاي جمعآوري شده به مدت 24 ساعت در دماي 30 درجه سانتیگراد گرم خانهگذاري شدند. پس از آن 10 گرم از هر نمونه در شرایط استریل با 90 میلی لیتر محلول سرم فیزیولوژي - کلرید سدیم 8/5 گرم در لیتر - مخلوط و یکنواخت گردید و در دستگاه استومکر - مدل سیوارد، ساخت کشور آلمان - براي یک دقیقه و با دور نرمال هموژن گردید. سپس محلول رویی به عنوان رقت 101 براي تهیه رقتهاي بعدي مورد استفاده قرار گرفت. رقت هاي 102 تا 105 در محلول کلرید سدیم 100 درصد تهیه شد. آزمایشات فوق در دو تکرار انجام شد
-3-2 روش کشت
به منظور کشت باکتري مخمرها از روش کشت سطحی استفاده شد. در این روش 0/1 میلی لیتر از رقت تهیه شده به وسیله سمپلر بر سطح محیط Y.G.C آگار تزریق و سپس با میلهي شیشهاي پخش شد. پس از خشک شدن، پلیتها در شرایط هوازي و دماي 25درجه سانتیگراد گرمخانهگذاري گردیدند
-4-2استخراج DNA از جدایه هاي مخمري
به منظور استخراج DNA از کلونیهاي تک خالصسازي شده، از کیتهاي استخراج - DNA - U.S .A, Fermentas صورت پذیرفت . بدین صورت که ابتدا 10 تا 20 میلی گرم از سلولهاي باکتریایی درون 200 ماکرولیتر TE بافر حل شد سپس 200میکرولیتر از نمونه را با 400 میکرولیتر از lysis solution مخلوط و در دماي 65 درجهسانتیگراد به مدت 5 دقیقه گرمخانه گذاري شد در ادامه فورا 600 میکرولیتر کلروفرم اضافه با 3 تا 5 بار زیر و رو کردن آرام مخلوط را امولسیفیه و نمونه در rpm١٠٠٠٠به مدت 2 دقیقه سانتریفوژ شد.
محلول precipitation solution گردید بدین منظور 720 میکرولیتر از آب دیونیزه استریل با 80 میکرولیترsupplied 10X concentrated Precipitation Solution مخلوط شد. در مرحله بعد قسمت آبی بالایی - سوپرناتانت - حاوي DNA را به یک تیوپ جدید انتقال داده 800 میکرولیتر از محلول تازه آماده شده مرحله 3 به آن اضافه شد. مخلوط را به آرامی به وسیله زیر و رو کردن به مدت 1 تا 2 دقیقه در دماي اتاق بهم زده شد و در 10000 rpm به مدت 2 دقیقه سانتریفوژ شد سپس سوپرناتانت به طور کامل جدا شد. و رسوب DNA به آرامی در 100 میکرولیتر از محلول NaCl حل شد.در انتها 300 میکرولیتر اتانول مطلق را اضافه کرده و اجازه داده شد تا DNA رسوب کرده - 10 دقیقه در -20 درجه سانتیگراد - و سپس به مدت 3 تا 4 دقیقه با سرعت rpm١٠٠٠٠ به مدت 3 تا 4 دقیقه سانتریفوژ و اتانول حذف شد. پس از این مراحل غلظت DNA بهوسیله اسپکتوفتومتري اندازه گیري شد
-5-2 واکنش PCR
واکنش PCR در حجم نهایی 50 میکرولیتر با مقادیر بهینه شدهي جدول 1 انجام پذیرفت. پرایمرهاي مورد استفاده جهت تکثیر ژنSrRNA۶٢ عبارت بودند از :
پرایمر F 5′ GGAACTCAGACACGGTCCAT 3 :Forward
پرایمر R5′ TACGGATTCCACCGCTAAAC 3′ :Reverse
