بخشی از مقاله
چکیده
آاروتنوییدها رنگدانه هاي آﱄ هستند آه در ﲤامی موجودات فتوسنتز آننده و برخی باآﱰي هاي غﲑفتوسنتزآننده یافت می شوند. آانتاگزانتﲔ1 نوعی از آاروتنوییدها و رنگدانه نارﳒی رنگی است آه با توجه به دارا بودن خواص رنگآنندگی و آنﱵ اآسیدانی, کاربرد فراوانی در صنایع غذایی, شیلات , دام, طیور, دارویی و آرایشی دارد. در این ﲢقیق یک سویه باآﱰیایی از فیلوسفر پسته جداسازي، شناسایی و از نظر بیوشیمیایی, تعیﲔ پروفیل آاروتنوییدي و بررسی شرایط ﲠینه دما وpH جهت رشد و تولید آانتاگزانتﲔ مورد مطالعه قرار گرفته است. نتایج حاصل از بررسی هاي بیوشیمیایی نشان داد آه سویه مذآور علﲑغم وجود تفاوت هاي جزیی, متعلق به گونه Kocuria rosea می باشد. تعیﲔ پروفیل آاروتنوییدي 2 سویه مذآور با روش3TLC اﳒام و نوع آاروتنویید آن آانتاگزانتﲔ تشخیص داده شد. به منظور ﲠینه سازي رشد و تولید آانتاگزانتﲔ از سویه مذآور, فاآتورهاي دما و pH مورد مطالعه قرار گرفتند. نتایج مشخص ﳕود آه دماي28°C وpH:7/0 براي رشد سویه مذآور و دماي 25°C وpH: 6/0 جهت تولید آانتاگزانتﲔ شرایط ﲠینه می باشد.
واژههاي آلیدي: آاروتنویید ، کانتاگزانتﲔ ،TLC , pH، پروفیل آاروتنوییدي, Kocuria rosea
مقدمه
کاروتنویید ها، هیدروکربن های غﲑ اشباعی هستند که طیف وسیعی از رنگ زرد تا قرمز را اﳚاد میکنند. آانتاگزانتﲔ - - 4,4'-diketo-β-carotene از انواع آاروتنوئیدها، داراي فرمول شیمیایی C40H52O2 و رنگدانه نارﳒی رنگی است آه عمدتا به عنوان افزودنی خوراآی به ویژه درجﲑه غذایی پرندگان به منظور اﳚاد رنگ قرمز در پر و پوست آن ها ، زرده ﲣم مرغ، بافت عضلانی ماهی ساﳌونید 4 ، به عنوان عامل برنزه آننده رنگ پوست در تولید آرمهاي برنزهآننده و نیز ترکیب آن با بتا آاروتن در تولید آرمهاي ﳏافظ پوست در برابر اشعه خورشید مورد استفاده بسیاري دارد. مدارک مستدل حاصل از مطالعات پزشکی نشان می دهد آه مصرف کاروتنوییدها در رژﱘ غذایی انسان به دلیل داشﱳ خواص آنتی اکسیدانی و جذب رادیکال های آزاد باعث کاهش بسیاری از بیماري ها از ﲨله بیماريهای قلبی، عروقی، سرطان و ایدز میشود - . - 1 بنابراین آانتاگزانتﲔ ماده اي با ارزش اقتصادي بالا و آاربردي در صنایع غذایی، دام، طیور، شیلات، دارویی و آرایشی ﳏسوب می گردد. تاکنون بیش از 600 نوع کاروتنوئید شناخته شده است که اغلب به صورت سنتزی تولید میشوند. با توجه به اثرات جانبی مواد شیمیایی بر بدن، دستیابی به منابع طبیعی تولید کننده کاروتنوییدها از اﳘیت بسزایی برخوردار است. در این ﲢقیق یک سویه باآﱰیایی از فیلوسفر پسته جداسازي، شناسایی و از نظر بیوشیمیایی, تعیﲔ پروفیل آاروتنوییدي و بررسی شرایط ﲠینه دما وpH جهت رشد و تولید آانتاگزانتﲔ مورد مطالعه قرار گرفته است.
مواد و روش ها جداسازي و شناسایی بیوشیمیایی جدایه مورد مطالعه جدایه مورد مطالعه با استفاده از سري رقت از فیلوسفر درختان پسته استان قزوین جداسازي گردید. خصوصیات بیوشیمیایی، فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی جدایه مورد بررسی بر اساس آزمون هاي گرم، کاتالاز، اکسیداز، تولید لوان، آرژنﲔ دهیدرولاز، آزمون وجود تاژک در دماي 28 و37 درجه سانﱵ گراد، استفاده از سیﱰات ، تولید اسید از گلوآز، گلیسرول و مانوز، هیدرولیز اسکولﲔ و نشاسته ، توانایی رشد در 37 ° C، ﲢمل ﳕک طعام با غلظت هاي 5% و 7/5%، توانایی رشد روي ﳏیط فورازولیدن آگار - - FTP و آزمون هوازي/بی هوازي با استفاده از ﳏیط Oxidative/Fermentative Agar مورد ارزیابی قرار - ﲥیه شده
سوش باکﱰي درﳏیط کشت - TSBY - Tryptic Soy Broth, 30 g/l; Yeast Extract, 3g/l کشت داده شد وبه مدت 6 روز در شیکر انکوباتور با دماي 28°C وسرعت چرخش 150 دور بر دقیقه قرار گرفت. استخراج رنگدانه از 10 میلی لیﱰاز این ﳕونه ها توسط10 میلی لیﱰ اتانل96 درجه اﳒام شد. میزان جذب ﳕونه ها توسط روش اسپکﱰوفتومﱰی در طول موج 485 نانومﱰ اندازه گﲑي و توسط اسپکﱰوفتومﱰ اسکن ﲥیه شد. برای تعیﲔ نوع کاروتنویید از روش TLC استفاده شد و از باکﱰی Dietzia natrolominaea HS-1 که نوع کاروتنویید آن با روش UV-HPLC/APCI5-MS تعیﲔ شده است, به عنوان استاندارد کانتاگزانتﲔ استفاده گردید - . - 3
جهت اﳒام TLC پس از استخراج رنگ، اتانل توسط گاز ازت, تبخﲑ و استون جایگزین آن شد .سپس مراحل TLC برروی ﳕونه کاروتنویید استخراج شده از سویه مذآور , ﳕونه آانتاگزانتﲔ استاندارد و ﳘچنﲔ ترکیبی از ﳕونه و استاندارد هر سه در کنار یکدیگر, بر روی ورق TLC و در سه مرحله اﳒام شد. ترکیب حلال ها به ترتیب, هگزان: استون 7:1 ،7:3 و 1:1 بود . - 4 - بررسی تاثﲑ فاآتورهاي دما بر رشد و تولید کاروتنویید ارلن های ﳏیط کشت مورد استفاده براي آشت سویه ، TSBY بود که در 250 میلی لیﱰی و در هر ارلن 50 میلی لیﱰ ﳏیط کشت ﲥیه و اسﱰیل شد. براي بررسی تاثﲑ دما، پس از تلقیح ﳏیط ها از پﱰي دیش ، ارلن ها به مدت 6 روز در شیکر انکوباتور با دماهای 25، 28 و 35 درجه سانتیگراد و سرعت چرخش 150 دور بر دقیقه قرار گرفتند. پس از این مدت میزان جذب ﳕونه ها توسط روش اسپکﱰوفتومﱰی در طول موج 600 نانومﱰ تعیﲔ گردید.
ﳘچنﲔ استخراج کاروتنویید از 10میلی لیﱰاز این ﳕونه ها توسط 5 میلی لیﱰ اتانل 96 درجه اﳒام شد و میزان جذب ﳕونه ها به روش اسپکﱰوفتومﱰی در طول موج 485 نانومﱰ تعیﲔ گردید. بررسی تاثﲑ pH بر رشد و تولید آاروتنویید بدین منظور ﳏیط کشت TSBY در ارلن های 250 میلی لیﱰی و در هرارلن 50 میلی لیﱰ ﳏیط کشت ﲥیه شد و pH آهنا پیش از اسﱰیل شدن روی 5/0، 6/0، 7/0، 8/0 و9/0 تنظیم گردید. با توجه به نتایج آزمایشات دما، از ﳏیط مایع مرحله قبل که جدایه مذآور در دمای 28°C رشد کرده بود به عنوان پیش کشت - Preculture - استفاده گردید. تلقیح به میزان 10 ٪ اﳒام شد و ارلن ها به مدت 6 روز در شیکر انکوباتور با دمای 28°C و سرعت چرخش150 دور بر دقیقه قرار گرفتند. پس از فرایند ﲣمﲑ، میزان توده سلولی به روش وزن خشک تعیﲔ شد. ﳘچنﲔ استخراج رنگدانه اﳒام و میزان جذب ﳕونه ها به روش مذآور تعیﲔ شد.
نتایج و ﲝث
با اﳒام آزمون هاي بیوشیمیایی مشخص گردید آه سویه مورد مطالعه متعلق به گونه Kocuria rosea می باشد. پس از ﲥیه سویه استاندارد و اﳒام ﳎدد و آامل تر آزمون هاي بیوشیمیایی مشخص گردید آه سویه جداشده تقریبا در ﲤام خصوصیات با سویه استاندارد مشابه بوده و فقط در هیدرولیز نشاسته و اسکولﲔ با هم متفاوت می باشند. در مورد تعیﲔ پروفیل آاروتنوییدي، Rf6 هاي ﳏاسبه شده از آزمایشTLC به ترتیب مراحل اﳒام 0/6 , 0/1 و 0/9 - 1/0 بود. باتوجه به اسکن گرفته شده از کاروتنویید استخراج شده از سویه مذآور و مقایسه آن با منابع - - 5 و ﳘچنﲔ عکس های ﲥیه شده از مراحل - TLC شکل - 1، یکسان بودن Rf ها و ﳘچنﲔ وجود
