بخشی از مقاله
چکیده
سالانه افزایش بروز دیابت میزان نیاز به انسولین را افزایش می دهد. بنابراین، باید روشهاي اقتصادي تري براي تولید انسولین پیش بینی گردد. محدودیت در ظرفیت تولید و پرهزینه بودن، مشکلات فناوریهاي کنونی تولید انسولین هستند. هدف از این تحقیق، بررسی سیستمهاي مختلف تولید پروتئینهاي نوترکیب براي بهبود تولید اقتصادي انسولین می باشد. در گام اول، با استفاده از یک جفت پرایمر اختصاصی، cDNAي مربوط به انسولین انسانی با استفاده از روش رونویسی معکوس از سلولهاي انسانی کشت شده تکثیر گردید.
قطعه 336 بازي که تنها حاوي توالیهاي کد کننده پروتئین IGF1 بود، پس از توالی یابی و تایید توالی، در وکتور پایه pMCS5 کلون گردید. براي بررسی بیان پروتئین در سه نوع سیستم متفاوت شامل E. coli، مخمر و گیاه، این توالی در سه نوع وکتور بیان در بین پروموتر و ترمیناتور مناسب کلون شدند. براي بیان ژن در مخمر از وکتور pGBKT7 و براي بیان پروتئین در E. coli، از وکتور بیان pGEX-2K استفاده شد که به ترتیب براي بیان پروتئین نوترکیب در مخمر و E. coli از کارآیی بالایی برخوردارند.
براي بیان این ژن در گیاه، توالی کلون شده در وکتور اختصاصی انتقال ژن به کلروپلاست تنباکو قرار گرفت. براي تنظیم رونویسی ژن در کلروپلاست، از پروموتر مربوط به RNAي ریبوزومی - Prrn - 16S و ترمیناتور زیرواحد بزرگ روبیسکو - TrbcL - از کلروپلاست تنباکو استفاده شد. از آنجا که توالیهاي استفاده شده از ژنوم پلاستید تنباکو در ساختار وکتور طراحی شده بسیار شبیه به پلاستوم گیاه کاهو می باشد، بنابراین می توان از این وکتور براي انتقال ژن به کلروپلاست کاهو نیز استفاده کرد.
مقدمه
تقریبا 0/7 درصد از جمعیت جهان به دیابت نوع یک یا دیابت وابسته به انسولین مبتلا هستند. میزان بروز این نوع دیابت در 25 سال آینده دو برابر نیز خواهد شد. در حال حاضر دیابت سومین عامل بزرگ مرگ و میر درکشورهاي صنعتی بعد از بیماریهاي قلبی-عروقی و سرطان می باشد. امروزه تزریق انسولین تنها روش موثر براي درمان دیابت می باشد. متاسفانه درد و ناراحتی که در سیستم تزریقی وجود دارد، بیمار را به عدم رعایت دقیق تزریق سوق می دهد، که براي حل این مشکل از روشهاي دیگري از قبیل اعمال انسولین از طریق ریه ها، بینی و دهان استفاده می شود.
این روشها پذیرش درمان را افزایش می دهند، ولی در این حالت معمولا به 5-20 برابر دوز بیشتري از انسولین نیاز است . - 1 - پس با توجه به افزایش بروز دیابت و نیاز به دوز بالاتر آن به طور چشمگیري نیاز به انسولین افزایش پیدا کرده است، بنابراین ضروري است که روشهاي اقتصادي تري براي تولید انسولین در نظر گرفته شود. در ان تحقیق، هدف نهایی، معرفی یک روش مناسب براي تولید اقتصادي انسولین انسانی در داخل کشور می باشد.
مو اد و روش ها
براي استخراج RNA، ابتدا سلولهاي انسانی در ازت مایع کوبیده شد. سپس، RNAي کل با استفاده از روش تریزول استخراج گردید. براي تهیه cDNA، 14 میکرولیتر محلول واکنش حاوي 5 μg از RNAي استخراج شده، 10 پیکومول الیگونوکلوتید پلی T، 10 mM از مخلوط dNTP، در دماي 65 °C قرار داده شد و پس از 5 دقیقه، بلافاصله روي یخ منتقل گردید. پس از یک دقیقه، 4 μl بافر 5 برابر غلظت مخصوص واکنش رونویسی معکوس، DTT 1 μl یک دهم مولار، MgCl2 1 μl پنجاه میلی مولار و 0/5 μl آنزیم Super Script III، به محلول واکنش اضافه گردید.
نتایج و بحث
ابتدا cDNAي ژن IGF1 - با اندازه - 336 bp با استفاده از تکنیک رونویسی معکوس و یک جفت پرایمر اختصاصی که بر اساس توالیهاي موجود در سایت NCBI با طراحی گردیدند، از سلولهاي انسانی تکثیر و جداسازي گردید - شکل . - 1 شکل -1 تصویر الکتروفورز محصول PCR حاصل از تکثیر cDNAي ژن IGF1 - با اندازه - 336 bp، با استفاده از جفت پرایمر اختصاصی این ژن. 1 و 2 نشان دهنده دو تکرار مستقل هستند. :M مارکر پس از جداسازي، با استفاده از سایتهاي برشی NdeI و BamHI که در ساختار پرایمرها تعبیه شده بودند، cDNAي مذکور در داخل پلاسمید pGBKT7 کلون گردید.
این پلاسمید براي بیان پروتئین در مخمر بسیار مناسب می باشد و بنابراین، پس از تایید توالی پلاسمید بدست آمده، از آن براي انتقال ژن IGF1 جهت بیان آن در مخمر استفاده شد. مخمرهاي تراریخت گزینش شده و در محیط کشت مایع تکثیر شدند. میزان بیان پروتئین IGF در کشتهاي حاصل در حال بررسی می باشد. براي اینکه بتوانیم این توالی را در وکتورهاي مناسب انتقال ژن به E. coli و کلروپلاست گیاهان کلون کنیم، ابتدا این توالی را در وکتور پایه pMCS5 کلون کردیم تا محدوده استفاده از آنزیمهاي برشی براي کلون کردن افزایش یابد. سپس این توالی با استفاده سایتهاي برشی NdeI و XbaI به وکتور pHK20 که حاوي این سایتهاي برشی در بین پروموتر Prrn و ترمیناتور TrbcL می باشد، منتقل شد.
لازم به ذکر است که پروموتر و ترمیناتور قبلا از پلاستوم کلروپلاستهاي تنباکو جداسازي و در این وکتور کلون شده بودند. در نهایت، کاست حاصل به وکتور نهایی انتقال ژن به کلرولاست که حاوي ژن انتخابگر aadA می باشد، منتقل شده و براي انتقال ژن به کلروپلاست تنباکو و کتهو مورد استفاده قرار خواهد گرفت. براي بیان پروتئین در E. coli نیز از وکتور بیان pGEX-2K استفاده می شود. هم اکنون در دنیا بیشتر انسولینی که در دسترس می باشد در E. coli و S.cerevisiae سنتز می گردد. ساخت و حفاظت سیستم هاي تخمیر بسیار گران قیمت می باشد.
علاوه بر آن ایجاد Inclusion bodies در E.coli و یا تنوع فعالیت بیولوژیکی فرمهاي متفاوت IGF1 در مخمر، عیبهاي سیستم هاي تولید کنونی می باشند - . - 2 گیاهان ترانس ژنیک سیستم هاي بیان مناسبی براي تولید پروتئین هاي نوترکیب در مقیاس بالا در سطوح صنعتی می باشند. سیستم هاي گیاهی مزیت هاي بسیاري از جمله هزینه ي کم رشد گیاهان در مقیاس وسیع، دسترسی به ارگانهاي طبیعی ذخیره ي پروتئین و تعیین روشهاي مناسب براي برداشت کارآمد، انتقال، انبار و فراوري آنها را دارند.
برآورد می شود که هزینه ي تولید پروتئین نوترکیب در گیاهان 10-50 برابر کمتر از هزینه ي تولید پروتئین مشابه در E.coli از طریق تخمیر می باشد. با این وجود، مشکل عمده در بیان پروتئین هاي انسانی از طریق ژنوم هسته اي، سطح کم بیان آنها می باشد که اکثرا کمتر از % 1 کل پروتئین هاي محلول می باشد. براي مثال، سطح بیان IGF1 در هسته ي تنباکو و برنج بعد از بهینه کردن شرایط بیان ژن، حدود 22-113 ng/mg می باشد . - 3 - مطالعات نشان می دهند که کلروپلاست ها اندامکهاي مناسب تري براي بیان پروتئینهاي نوترکیب در سطوح بالا می باشد، بطوریکه گاهی اوقات میزان بیان پروتئین نوترکیب تا حدود % 50 از کل پروتئین محلول قابل افزایش است . - 4 - بنابراین، در این مطالعه سعی می شود که از این سیستم براي تولید انسولین انسانی در سطح اقتصادي استفاده شود.
