بخشی از مقاله
چکیده:
پلی هیدروکسی الکانواتها بیوپلیمرهاي زیستی تخریب پذیر1 می باشند که در بسیاري از باکتریها تحت شرایط استرس به عنوان منبع کربن و انرژي ذخیره می شوند . هدف اصلی این تحقیق جداسازي و شناسایی باکتري با قابلیت مطلوب تولید بیوپلیمرPHA می باشد . به این منظور باکتریهاي مختلف از پساب کارخانه تولید روغن زیتون جداسازي و خالص سازي شد . نمونه ها ابتدا با استفاده از روش رنگ آمیزي سودان سیاه با میکروسکوپ نوري ، از نظر تولید این بیوپلیمرمورد بررسی قرار گرفتند . .باکتري هایی که در رنگ آمیزي سودان سیاه گرانولهاي PHA را نشان دادند ، جهت بررسی تکمیلی مورد آزمون GC-MS نیز قرار گرفتند . یک باکتري که بیشترین میزان تولیدرا نشان می داد جهت انجام بررسی هاي بعدي در این تحقیق انتخاب شد . این باکتري از نظر ویژگیهاي مورفولوژیکی و بیوشیمیایی و آنالیز ترادف ژنی 16SrRNAمورد بررسی قرار گرفت .
آنالیز فیلوژنتیکی بر پایه توالی ژنی 16SrRNA به کمک نرم افزارMega4 نشان داد که باکتري در جنس Bacillus. Sp قرار می گیرد . شرایط دمایی 30oc، 37oc، 41oc به عنوان شرایط دمایی مختلف براي رشد این باکتري در نظر گرفته شد . باکتري در محیطM1 کشت داده شد ودر زمانهاي 24، 48 ،72 و 98ساعت جهت بررسی توان تولید PHA مورد آزمون GC-MS قرار گرفت . بیشترین میزان رشد سلولی ، تولید و تجمع PHA در سلول در دماي 37oc و زمان 72 ساعت بدست آمد - به ترتیب1/32g/L ، 0/93g/L ، ٪ . - 70/2 این بررسی ها نشان داد که باکتري مورد نظر در مقایسه با بسیاري از باکتریها داراي توان تولید بالایی می باشد و همچنین دماي محیط رشد تأثیر بسیار زیادي برروي رشد باکتري و متعاقباً تولید PHA دارد.
کلمات کلیدي : پلی هیدروکسی آلکانوات ، زیست تخریب پذیر، 16SrRNA، . GC-MS
مقدمه:
به علت رشد روزافزون جمعیت و تمایل فراوان به استفاده از پلاستیکها، امروزه دفع این مواد در طبیعت به یکی از مسائل مهم زیست محیطی تبدیل شده است . این مواد به کندي در طبیعت تجزیه شده و به طور متوسط صدها سال در طبیعت باقی می مانند. یکی دیگر از مشکلات استفاده از پلاستیکها این است که این مواد از منابع فسیلی و تجدیدناپذیر تهیه می شوند. اما این منابع بسیار محدود می باشند و اگر به همین صورت پیش رود تا چند سال آینده میزان تقاضا براي این منابع از میزان اندوخته این مواد بیشتر خواهد شد . بدلیل این مشکلات امروزه علاقه زیادي به مطالعه و تحقیق براي تولید پلاستیکهاي زیستی تخریب پذیر بوجود آمده است .
این مواد از منابع تجدید پذیر تهیه می شوند و منجر به کاهش ذخایر محدود طبیعت نمی شوند و برخلاف پلاستیکهایی که منشأ نفتی دارند در مدت کمتر از یکسال به طور کامل تجزیه می شوند.میکروارگانیسمها از نظرتوانایی و نوع تولید PHA با یکدیگر متفاوتند. بنابراین انتخاب میکروارگانیسم یکی از مسائل مهم در تولید PHA بحساب می آید. در سالهاي اخیر تلاش زیادي براي شناسایی باکتریهایی با توان تولید بالاي PHA صورت گرفته است . به دلیل عدم تحقیقات کافی در این موارد در کشورما، تصور می شود جاي مطالعات زیادي در این موارد وجود دارد ، لذا در این تحقیق تلاش نمودیم تا باکتري با توان تولید مطلوب را شناسا یی و معرفی نماییم .
مواد و روشها :
-1 تهیه نمونه و جداسازي باکتري
جهت تهیه نمونه باکتري از عمقهاي مختلف پساب کارخانه روغن کشی گنجه رودبار - واقع در شهرستان رودبار گیلان - نمونهبرداري شد،و نمونه هاي پساب در ظروف 250 میلی لیتري استریل تهیه و به آزمایشگاه منتقل گردید.نمونه هاي مختلف در آزمایشگاه بوسیله آب مقطر استریل تا چند برابر رقیق شدند. سپس 0/25ml از نمونه هاي رقیق شده با غلظت 10 3 و 10 4 برروي پلیتهاي محتوي محیط نوترینت آگارپخش شدند. سپس پلیتها در دماي 30oc به مدت هفت روز رشد داده شدند. کلنی هایی که بر روي آگار رشد کرده بودند. براساس رنگ، اندازه، برآمدگی،شکل و زمان ظهور از یکدیگر تفکیک شدند.
-2 بررسی تولید بیوپلیمر:
سویه هاي جداسازي شده با استفاده از رنگ آمیزي سودان سیاه و مشاهده در زیر میکروسکوپ نوري جهت تولید PHA مورد بررسی قرار گرفتند . در این روش سلولهاي باکتري به رنگ صورتی و گرانولها به رنگ سیاه مشاهده شدند.در این مطالعه از محیط کشت M1 به عنوان محیط کشت تخمیر استفاده شد. و شرایط تولید و در دماهاي متفاوت 30oc، 37oc، 41oc موردبررسی قرار گرفت و در زمانهاي 24، 72،48و72 ساعت از محیط کشت نمونه برداري شد و پس از تهیه سلول خشک با استفاده از روش برانگ و همکاران استخراج متیل استر صورت گرفت . براي انجام GC-MS اسپکترومتري، 1 میکرولیترازمتیل استر بدست آمده - آماده شده براي تزریق به دستگاه - GC به دستگاه GC-MS با ستون موئینه 30mm - ، HP5، - id=0/25mm تزریق شد. طیف برخورد جرم با الکترون ev گرفته شد. طیف حاصل از قطعه قطعه شدن جرم با طیف نمونه هاي استاندارد موجود در حافظه دستگاه مقایسه و اجزا شناسایی شدند.
-3 شناسایی باکتري:
جهت تعیین مشخصات میکروسکوپی باکتري آزمایشهاي رنگ آمیزي گرم و اسپورصورت گرفت. همچنین جهت شناسایی باکتري مورد نظر تستهاي بیوشیمیایی معمول بروي باکتري صورت گرفت. و جهت شناسایی مولکولی،پس از استخرج DNA ، ژن16SrRNAبا پرایمرهاي 27F و 1492 R در واکنش PCR در 30چرخه با Tm=54 تکثیر شد.توالی بدست آمده در بانک اطلاعاتی NCBI قرار گرفت و با استفاده از نرم افزار Fasta نزدیکترین توالی ها به توالی مورد نظر شناخته شد. سپس اطلاعات بدست آمده به کمک نرم افزار MEGA4 طبقه بندي شده و میزان شباهت و تفاوت باکتري مورد نظر با سایر باکتري ها مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج و بحث :
در این تحقیق 40 جدایه باکتریایی شامل 23جدایه گرم مثبت و 17 جدایه گرم منفی با استفاده از محیط کشت نوترینت، از پساب کارخانه روغن کشی زیتون جداسازي شدند. جدایه ها توسط رنگ آمیزي سودان سیاه مورد بررسی اولیه جهت تولید PHAقرار گرفتند . با غربالگري اولیه سویه هاي مولد PHA بااستفاده از رنگ آمیزي سودان سیاه و بررسی با میکروسکوپ نوري و غربالگري ثانوي با سنجش میزان تولید توسط آنالیز GC-MS ، یک باکتري با بیشترین توانایی تولید PHA انتخاب و مورد شناسایی و بررسی قرار گرفت . در نتیجه رنگ آمیزي گرم باکتریهاي گرم مثبت میله اي شکل و رشته اي بسیار درشت در زیر میکروسکوپ مشاهده شد.
بررسی نتایج تستهاي بیوشیمیایی با باکتري Bacillus مطابقت داشت. و آنالیزفیلوژنتیکی برپایه ترادف ژنی16SrRNA نیز تایید نمود که باکتري در جنس باسیلوس قرار می گیرد ، و بیشترین شباهت و همخوانی را با باکتري Bacillus Thuringiensis دارد. باکتري مورد نظر Bacillus sp.FA01 نامیده شد .جهت بررسی اثر دما بر روي تولید بیوپلیمر شرایط دمایی 30oc، 37oc، 41oc به عنوان شرایط رشد مختلف براي این باکتري در نظر گرفته شد. رشد باکتري در دماي 41oc بسیار کم و ناچیز بود. در نتیجه تولید PHA در این دما صورت نگرفت. رشد سلولی در دماي 30oc نسبت به دماي 37oc کمتر و در حدود L 0/ 6 g میباشد و علاوه بر آن میزان تولید و تجمع PHAدر سلول هم در این حالت کم و به ترتیب به مقدار L 23 / 5% , ~0/14g می باشد. در حالی که در دماي 37oc رشد سلولی بالاتري - 1/32g/L - را نشان می دهد.
متعاقباً. میزان تولید PHA و تجمع آن در سلول به ترتیب به میزان0/93 g/L و ٪ 70/2 می رسد. این میزان در مقایسه با نتایج بدست آمده از سایر تحقیقات مناسب به نظر می رسد. تاکنون با لا ترین میزان تجمع PHB در R.eutropha گزارش شده است این باکتري می تواند تا 90% وزن خشک خود نیز PHB ذخیره نماید. امامشکل اینجاست که PHB پلیمري بسیار خشک و شکننده است و خصوصیات تجاري مناسبی ندارد لذا یافتن باکتریهاي با قابلیت تولید کوپلیمر مطلوب به نظر می رسد . باکتري مورد بررسی داراي قابلیت تولید کوپلیمر با مونومرهاي MCLs می باشد که از نظر تجاري مورد پسند می باشند . نتایج این تحقیقات نشان داد که این باکتري در مقایسه با بسیاري از باکتریها توانایی تولید مناسبی دارد و همچنین از نظر کیفیت بیوپلیمر تولیدي نیز مناسب می باشد .
