بخشی از مقاله
جداسازی باکتری استافيلوکوکوس سيمولانس توليد کننده لیزواستافین، از ورم پستان گاوی و شناسایی آن بر اساس تعیین توالی S rRNA16
چکیده
سابقه ور های ف: استافیلوکوکوس سیمولانس یک کوکسی گرم مثبت و خوشه ای می باشد که از پوست، ادرار و نمونه های بالینی انسان و حیوان به ویژه عفونت پستان گاوی جداسازی شده است. این پژوهشی با هدف جداسازی و شناسایی باکتری استافيلوکوکوس سيمولانس توليد کننده ليزو استافين، از ورم پستان گاوی و نیز معرفی آن به عنوان یک عامل درمانی جدید در درمان عفونت های استافیلوکوکی انجام شده است. مواد و روش ها: این پژوهش به صورت مقطعی - توصیفی بر روی نمونه های جمع آوری شده از پستان گاوهای مبتلا به عفونت پستان در گاوداری مرکز علمی و کاربردی جهاد کشاورزی واقع در کیلومتر ۶ جاده چشمه علی دامغان، استان سمنان انجام گرفت. نمونه ها پس از کشت بر روی محیط نوترینت آگار با رنگ آمیزی گرم و آزمون های بیوشیمیایی مورد بررسی قرار گرفتند. پس از استخراج DNA از نمونه های مشکوک به استافیلوکوکوس سیمولانسی، به منظور شناسایی دقیقی باکتری و بررسی وجود ژن لیزواستافین در سویه از روش PCR و تعیین توالی استفاده گردید. یافته ها: از مجموع ۶۱ کوکسی گرم مثبت خوشه ای جداشده از نمونه های ورم پستان گاوی، یک مورد باکتری استافیلوکوکوس سیمولانس شناسایی گردید. تعیین توالی قطعه 16SrRNA باکتری نیز صحت جداسازی را تأیید نمود. نتیجه گیری: با توجه به اولین گزارش جداسازی باکتری استافیلوکوکوس سیمولانس از ورم پستان گاوی در ایران و نیز کارایی بالقوه لیزواستافین تولید شده توسط باکتری، می توان از این ترکیب در درمان عفونت های باکتریایی مقاوم به آنتی بیوتیک استفاده
نمود.
واژگان کلیدی: استلافی الوکوکوس سیمولانس، لیزو استافین، ورم پستان گاوی، 16S rRNA.
مقدمه
باکتری استا فیلوکوکوس سیمولانس Staphylococcus SimulaIIS) یک کوکسی گرم مثبت خوشه ای، غیر متحرک و فاقد اسپور می باشد که در پوست، ادرار و نمونه های بالینی انسان و حیوان وجود دارد (۱). بیووار استافیلولیتیکوس این باکتری، قادر به تولید یک اندو پپتیداز خارج سلولی به نام گلایسیل گلایسین (لیزواستافین) می باشد. این آنزیم موجب هیدرولیز پل های متقاطع پپتیدوگلیکان دیواره سلولی دیگر استافيلوکوک ها به ویژه استافيلوکوکوس /ورئوس (S. dureus)
می گردد (۴-۲). با توجه به افزایش مقاومت و کاهش اثر آنتی بیوتیک های رایج در درمان عفونت های استافیلوکوکی، مطالعات تحقیقاتی بر روی ارزیابی لیزواستافین به عنوان یک عامل درمانی نوین برای عفونت های استافیلوکوکی در حال انجام است (۷-۵). هدف از این پژوهش جداسازی و شناسایی باکتری استافيلوکوکوس سيمولانس توليد کننده لیزواستافین، از ورم پستان گاوی و نیز معرفی این باکتری به عنوان عامل درمانی جدید در درمان عفونت های استافیلوکوکی به منظور انجام مطالعات بیشتر بود.
مواد و روش ها الف) نمونه گیری: در این مطالعه مقطعی - توصیفی نمونه گیری از گاوداری مرکز علمی کاربردی جهاد کشاورزی واقع در کیلومتر ۶ جاده چشمه علی دامغان در استان سمنان انجام گرفت. تمامی گاوهای مورد بررسی در این پژوهش مبتلا به بیماری ورم پستان بودند (۸). در ابتدا با استفاده از سوآب استریل آغشته به سرم فیزیولوژی، از چندین ناحیه پستان شامل نوک، پوست و شیر پستان عفونی نمونه گیری به عمل آمد. سپس نمونه ها بر روی محیط نوترینت آگار کشت و در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت ۲۴ ساعت گرماگذاری شلنل. ب) غربال گری سوریه های باکتری: به منظور خالص سازی کلنی های رشد یافته بر روی محیط نوترینت آگار، باکتری ها مجدداً بر روی محیط یاد شده کشت و در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت ۲۴ ساعت گرماگذاری شدند. باکتری های رشد یافته به کمک آزمون های بیوشیمیایی عمومی و اختصاصی، مطابق با روش استاندارد مورد بررسی قرار گرفتند (۱). همچنین کلنی های ایجاد شده از نظر شکل، رنگ، بو، قوام و اندازه ارزیابی گردیدند. در ادامه به منظور غربال گری کوکسی های گرم مثبت خوشه ای و اطمینان از خلوص آنها، رنگ آمیزی گرم از نمونه ها تهیه شد. ج) جالاسازی باکتری ما۔ ف: پس از غربال گری کوکسی های گرم مثبت خوشه ای، بر اساس جدول افتراقی استافیلوکوک ها برای هر یک از آنها آزمون های کاتالاز، اکسیداز، کوآگولاز،
احیای نیترات، DNase، آزمون حساسیت به آنتی بیوتیک های نوو بیوسین و پلی میکسین ONPG B، و اوره آز با روش های استاندارد به عمل آمد (۱). پس از انجام آزمون های مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی، در مرحله بعد از آزمون های بیوشیمیایی استفاده گردید. د) استخراج DNA DNA باکتری مطابق با روش کادو (Kado) و لیو (Liu) در سال ۱۹۸۱ با اندکی تغییرات انجام گرفت (۹). پس از میکروفیوژ ۲ میلی لیتر از کشت تازه باکتری، به رسوب سلولی حاصل ۱۵۰ میکرولیتر محلول I (Tris-Acetate 40 mM, Sodium EDTA 2 mM, pH 7.9) 50 mM, SDS3%, pH 126) II J- ۲۰۰ میکرولیتر TriS) اضافه گردید (۹).
سپس باکتری های لیز شده با ۹۰۰ میکرولیتر محلول فنلی - کلروفرم عصاره گیری شدند. با افزودن ایزوپروپانل، DNA از فاز آبی رسوب داده شد. پس از شستشو با اتانل، DNA ژنومی در ۵۰ میکرولیتر آب مقطر حل گردید. در نهایت، DNA استخراج شده بر روی ژل آگاروز ۱ درصد به مدت ۴۰ دقیقه در ۸۰ ولت الکتروفورز شد (۱۰).
ه) PCR ژن در این مطالعه به منظور تکثیر ناحیه باکتری هدف از پرایمرهای عمورمی استفاده گردید.واکنش PCR با حجم نهایی ۲۵ میکرولیتر شامل: ۱۰ نانو گرم در میکرولیتر DNA الگو، ۰/۴ میکرومولار از هر پرایمر، ۰/۲ میکرومولار dNTP، ۲ میکرومولار MgCl2، ۲/۵ میکرولیتر بافر PCR وی1واحدآنزیم Taq DNA Polymeraseانجام گردید. در ادامه واکنش PCR در دستگاه ترموسایکلر (Thermal Cycler PeOLab Primus 25-United Kingdom) شرایط دمایی ۵ دقیقه واسرشت شدن ابتدایی در دمای ۹۴ درجه سانتی گراد و در ادامه ۳۵ چرخه شامل واسرشت شدن در دمای ۹۴ درجه سانتی گراد به مدت ۱ دقیقه، اتصال در دمای ۴۵ درجه سانتی گراد به مدت ۳۰ ثانیه، طویل شدن در دمای ۷۲ درجه سانتی گراد به مدت ۹۰ ثانیه و در نهایت طویل شدن نهایی در دمای ۷۲ درجه سانتی گراد به مدت ۵ دقیقه انجام شد در نهایت محصول PCRبه ژل آگزوز1درصد واجدآتیدیوم برماید منتقل وبه مدت 1ساعت درولتاز80ولت الکتروفولز گردید.
و) تخلیص محصولی PCR محصول PCR با استفاده از کیت .. Nucleic Acid Extraction Kit-Vivantis خالص سازی شد.محصول تخلیص شده برای توالی یابی به شرکت ژن فن آوران . ارسال گردید.
ز) PCR ژان لیزواستافین، از آنجایی که باکتری جداسازی شده در اين مطالعه (استافيلوکوکوس سيمولانس )، تنها باکتری توليد کننده آنزیم لیزواستافین می باشد، لذا در مرحله بعد به منظور شناسایی دقیقی باکتری و بررسی وجود لیزواستافین در سویه از روش PCR استفاده گردید. به منظور تکثیر ژن لیزواستافین (قطعه ۱۳۵۹ جفت بازی) از پرایمرهای اختصاصی برگرفته از سایت شامل
استفاده شد. غلظت نهایی هر واکنش گر برای واکنش PCR دقیقاً مطابق با غلظت اشاره شده در واکنش فوقی بود. واکنش PCR United Kingdom) با شرایط دمای ۵ دقیقه واسرشت شدن ابتدایی در دمای ۹۴ درجه سانتی گراد و در ادامه ۳۵ چرخه شامل واسرشت شدن در دمای ۹۴ درجه سانتی گراد به مدت ۱ دقیقه، اتصال در دمای ۵۷/۵ درجه سانتی گراد به مدت ۳۰ ثانیه، طویل شدن در دمای ۷۲ درجه سانتی گراد به مدت ۹۰ ثانیه و در نهایت طویل شدن نهایی در دمای ۷۲ درجه سانتی گراد به مدت ۵ دقیقه انجام شد. در نهایت محصول PCR به ژل آگاروز ۱ درصد واجد اتیدیوم برماید منتقل و الکتروفورز گردید.
یافته ها
الف) شناسایی باکتری: از مجموع کلنی های بررسی شده با رنگ آمیزی گرم، ۶۱ کوکسی گرم مثبت خوشه ای شناسایی گردید. از این میان تنها یک مورد باکتری استافیلوکوکوس سیمولانس پس ازانجام آزمون های مورفولوژی ,فیزیواوژی وبیوشیمیایی جداسازی شد.
جدول ۱: نتیجه آزمون های مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی باکتری S SimularIS
جدول ۲: نتایج آزمون های بیوشیمیایی به دست آمده از نمونه های ورم یستان گاوی
ب) تایید۔ استخحراج DNA الکتروفورز DNA استخراج شدہ از باکتری هدف، نشان دهنده ایجاد یک باند مشخص از DNAژنومی به همراه یک باند احتمالی از DNA پلاسمیدی بود (شکل ۱).
ج:تاییدPCRژن الکتروفورز محصولPCRباایجاد باند خالص ۱۴۹۴ جفت بازی نشان دهنده تکثیر صحیح ژن 16S rRNA بود (شکل ۲).
د) توالی تعیین ترادف شماده قطعه :
تعیین توالی قطعه تکثیر یافته باکتری استافیلوکوکو سر سیمولانس صحت جداسازی باکتری را تأیید نمود (شکل ۳).
