بخشی از مقاله
چکیده
در سال های اخیر مطالعه بروی میکروارگانیسم های تولید کننده انزیم لیپاز گرما-قلیا دوست جهت بکارگیری در صنایع شوینده افزایش یافته است. علت این امر، توانایی انزیم های گرما-قلیا دوست در حفظ فعالیت پایداری خود در دمای بالای 40œC، PH قلیایی،گسترده بودن سوبسترای اختصاصی و سازگاری با دیگر ترکیبات بکار رفته در پاک کننده ها می باشد که از ویژگی های بسیار مهم بمنظور استفاده در صنایع شوینده می باشد.
هدف از این پژوهش جداسازی، انتخاب و شناسایی یک باکتری قلیا-گرما دوست تولید کننده انزیم لیپاز برون سلولی از چشمه اب گرم قینرجه نیر از 6 کیلومتری جنوب غربی شهرستان نیر با دمای 60œC و =8.6 pH با هدف بکاگیری در صنایع شوینده در اینده بود. پس از رشد باکتری های تولید کننده لیپاز برون سلولی در نمونه ها در 10 PH، 9 و 8 در دمای 60œC در یک محیط سنتزی حاوی روغن زیتون بعنوان تنها منبع کربن انرژی، یک باکتری با pH =10 شد. یک سویه با نام 101MZV توسط سنجش کمی، با داشتن بالاترین میزان فعالیت ویژه انزیمی - - 0.018 U/mg Protein انتخاب شد و سایر بررسی ها روی آن انجام گردید.
نتایج تستهای فیلوژنتیکی 16s rDNA، بیوشیمیایی و مورفولوژیکی نشان داد که سویه 101MZV با 99% همولوژی بیشترین شباهت را به سویه Ochrobactrum intermedium دارد. در این مطالعه تاثیر فاکتورهایی مانند pH، دما، منابع مختلف نیتروژن، غلظت بهینه نیتروژن، منابع مختلف کربن روغنی، غلظت بهینه کربن روغنی مورد بررسی قرار گرفت، فعالیت ویژه انزیمی از - 0.018 U/mg Protein - به - 0.031 U/mg Protein - افزایش یافت.
مقدمه و هدف
لیپازها یا تری اسیل گلیسرول هیدرولازها - EC 3.1.1.3 - واکنش های هیدرولیزی و سنتزی را کاتالیز می کنند که در واکنش هیدرولیز تری اسیل گلیسرول را به گلیسرول و اسید چرب می شکنند.. [21] انزیم لیپاز در بسیاری از گونه های حیوانات، گیاهان، باکتری ها و قارچ ها یافت می شود اما انزیم لیپاز میکروبی به دلایل پایداری در حلال های الی، عدم نیاز به کوفاکتور جهت فعالیت، انتخاب گری فضایی خوب و سادگی در تولید به مقدار انبوه با هزینه کم در صنعت پر طرفدار می باشد .[3]
میکروارگانیسم های گرما-قلیا دوست را میتوان از محیط زیست های گوناگونی مثل گنداب های باتلاقی سرد و مناطق گرم قلیایی با pH دماهای متفاوت جداسازی کرد. جهت جداسازی باکتری با ویژگی خاص الزامی برای محدود شدن وجود ان باکتری در ان محدوده خاص نمی باشد، اما در محیط قلیایی و گرم احتمال وجود تعداد بیشتری از انها می باشد و به علل مختلفی باکتری های گرما-قلیا دوست در همه جا یافت می شوند.[9]استفاده از انزیم های حاصل از میکروارگانیسم های گرما-قلیا دوست در صنعت به دلیل ویژگی هایی مانند، پایداری با نیمه عمر طولانی در دمای بالا و حفظ فعالیت ویژه انزیمی در شرایط قلیایی بسیار زیاد را دارا می باشند، که این امر بیشتر در ساخت شویندهای لباس ها اهمییت دارد.
[3,2] بکارگیری انزیم لیپاز در صنایع مختلف ملزم به داشتن ویژگی های مناسب وسازگار با ان صنعت می باشد.[17,4] تولید انزیم های خارج سلولی مختلفی از میکروارگانیسم ها شامل پروتئاز، امیلاز و انزیم های لیپولیتیک در فرایندهای صنعتی همچون داروسازی، چرم سازی، ساخت شوینده ها، صنایع غذایی بسیار مهم محسوب می شوند .[10] برای بهبود تولید انزیم توسط باکتری نیازمند به بررسی فاکتورهای محیطی مؤثر بروی تولید و به دنبال ان ایجاد شرایط بهینه برای هر کدام از این فاکتور ها در حین تولید لازم می باشد .[3] تأثیر pH محیط کشت، بروی تولید لیپاز و نیز تأثیر دمای محیط همگی از عوامل محیطی هستند که تأثیر آنها بر روی تولید لیپاز، برای باکتری های مختلف مورد بررسی قرار گرفته است .[23] هدف از انجام این تحقیق جداسازی و در نهایت انتخاب و شناسایی یک سویه باکتریایی گرما-قلیا دوست تولید کننده لیپاز برون سلولی با هدف استفاده در صنایع شوینده و بدست اوردن شرایط بهینه ان می باشد.
تئوری و پیشینه تحقیق
احتمال حضور باکتری گرما- قلیادوست تولید کننده انزیم لیپاز از چشمه اب گرم قینرجه نیر با دمای 60œC و pH=8.6 ، بسیار زیاد می باشد و همچنین با بررسی فاکتورهای محیطی موثر بر تولید انزیم، احتمال افزایش میزان تولید انزیم لیپاز حاصل از سویه مورد نظر برای استفاده در صنایع شوینده ها بسیار زیاد می باشد.
مواد و روشها مواد مورد استفاده
پرایمرهای 20F و 1492R از شرکت پیشگام، پارانیتروفنول پالمیتات از Titrachem ، Rhodamin B و مابقی مواد و محیطهای مورد استفاده در این پژوهش از شرکت Merck تهیه شدند.
محیط کشت مایع پایه
این محیط جهت تلقیح اولیه که شامل 1g پپتون، 0.5 g عصاره مخمر، 1g کلرید سدیم ، % 1 روغن زیتون بعنوان تنها منبع انرژی و کربن و 90ml اب لوله و 10ml اب چشمه در ارلن 250ml ریخته شد. محیط کشت مورد نظر در دمای 60 œC، 8 pH، 9 و 10 تنظیم شد با دور rpm=120 به مدت 48 ساعت در شیکر-انکوباتور قرارداده شد.
جداسازی باکتری های تولید کننده انزیم لیپاز
جداسازی میکروارگانیسم های تولید کننده لیپاز از پلیت Rhodamine B agar برای تشخیص باکتری های لیپولیتیک، در معرض اشعه فرابنفش در طول موج 249 nm در اطراف کلنی های مولد لیپاز فلورسانس نارنجی و استراز صورتی ایجاد می کنند. این پلیت حاوی ترکیبات شامل 8g/l نوترینت براث، 4g/l کلرید سدیم، 10ml روغن زیتون، 10g اگار و 1 % - V/V - رودامین ب می باشد.[14] باکتری را در دمای 60 œC به مدت 72ساعت انکوبه شد.
روش سنجش انزیمی به طریق اسپکتروفوتومتری
جهت اماده سازی محلول سنجش فعالیت انزیمی، Para-nitrophenyl palmitate 30 mg را در ml 10 ایزوپروپانول حل کرده و به ان را به 90 ml از - pH= 8 - فسفات بافر 0.05 M و 207 mg سدیم داکسی کولات اضافه شد . برای تهیه سوپرناتانت سلولی 1.5 ml از محیط کشت را با دور 13300 × g بمدت 10 min سانتریفیوژ شد. سپس 0.1 ml از سوپرناتانت را به 2.4 ml از محلول فوق اضافه و بمدت 15 دقیقه در دمای 37 F انکوبه شد و پس از ان میزان جذب نوری در طول موج 410 nm خوانده شد. محلول تهیه شده فوق بهمراه 0.1 ml اب مقطر بعنوان شاهد در نظر گرفته شد.[1,18]
پروتین سنجی
از روش Lowry و همکاران در سال 1951 برای سنجش پروتئین محلول استفاده شد، به این ترتیب که از آلبومین سرم گاوی با غلظت 1 میلی گرم در میلی لیتر به منزله استاندارد استفاده و قرائت نوری در 750 نانومتر انجام شد .[15] در تمامی مراحل خالص سازی محلول پروتئینی از نظر فعالیت انزیمی، سنجش پروتئین اندازه گیری شد و فعالیت ویژه انزیمی ، بازده و تخلیص مورد محاسبه قرار گرفت.
شناسایی میکروارگانیسم جداسازی شده ازطریق روش 16s rDNA
شناسایی میکروارگانیسم مورد نظر بر اساس تست های بیوشیمیایی و تست مولکولی توالی یابی ژن rDNA 16s انجام شد. جهت انجام واکنش زنجیره ای DNA - PCR - سویه 101MZV به روش فنل کلروفورم استخراج شد.[19] بمنظور تکثیر قطعه 16srDNA از پرایمرهای 27F با توالی 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' و 1492R باتوالی 5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3' و پس از 5 دقیقه دناتوره شدن اولیه در دمای 94 œC، امپلیفیکیشن در مجموع 30 سیکل دناتوریشن 40 ثانیه در 94 œC، انالینگ 40 ثانیه 56 œC واکستیشن ا دقیقه در دمای 72 œC صورت گرفت. برای تائید و اطمینان از تکثیر قطعه 16s rDNA بروی ژل آگارز 1%، الکتروفورز شد.
بهینه سازی سویه جدا سازی شده در این پژوهش
منبع نیتروژن، منبع کربن، دما و pH فاکتورهای محیطی مهمی هستند که بر میزان تولید انزیم لیپاز توسط میکروارگانیسم موثر می باشند .[3] برای مقایسه ی فاکتورهای موثر رشد و تولید انزیم لیپاز، میزان فعالیت ویژه انزیمی محاسبه شد.
تاثیر منابع مختلف نیتروژن
جهت ارزیابی اثر منابع مختلف نیتروژن بر رشد و تولید انزیم لیپاز سویه 101MZV از Yeast extract، Peptone، NH4Cl، Whey و Urea با غلظت % 0.1 صورت گرفت. هر یک از این مواد در 100 ml در محیط کشت پایه معدنی و بهمراه 1%روغن زیتون بعنوان تنها منبع انرژی و کربن pH =10، دمای 60œC و دور شیکر rpm 120 در طی 6 روز مورد بررسی قرار گرفت. پس از بررسی موثر ترین منبع کربن بر افزایش تولید میزان انزیم لیپاز، از درصدهای % 0.3، % 0.4، % 0.5، % 0.6، % 0.7 بمنظور بهینه سازی درصد ان استفاده شد.
