بخشی از مقاله
چکیده
با وجود روش هاي متفاوت در نگهداري ژرم پلاسم گیاهی یکی از کم هزینه ترین و مطمئن ترین روش هابراي نگهداري مواد گیاهی از جمله دانه هاي روغنی حفاظت انجمادي می باشد. در این آزمایش حفاظت انجمادي به روش شیشه اي شدن بر روي بذر دو ژنوتیپ کلزا به نام هاي ARC-2 و Milena با دو نوع محلول حفاظت کننده PVS2 و PVS3بر پایه طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار و بصورت فاکتوریل انجام گردید.تیمار ها شامل دو نوع محلول حفاظتی و دو ژنوتیپ و 5 سطح زمانی 20 - ، 40، 60، 80، 100 دقیقه - براي تیمار با محلول بود. براي بررسی بیشتر نتایج تیمار هاي اعمال شده دو صفت طول ریشه چه و طول ساقه چه اندازه گیري شد.
نتایج حاصل از تجزیه واریانس داده ها نشان داد براي صفت درصد جوانه زنی دو فاکتور زمان و ژنوتیپ و اثر متقابل این دو فاکتور در سطح 0/01 و اثر متقابل زمان تیمار با نوع محلول هاي حفاظت کننده داراي اثر معنی دار در سطح 0/05 بود. براي صفت طول ریشه چه دو فاکتور زمان و ژنوتیپ و اثر متقابل این دو فاکتور داراي اثر معنی دار در سطح 0/01 و اثر متقابل ژنوتیپ در نوع محلول و اثر متقابل سه گانه داراي اثر معنی دار در سطح 0/05 مشاهده گردید. همچنین براي صفت طول ریشه چه فاکتور زمان تیمار و اثر متقابل سه گانه در سطح 0/01 معنی دار گردیده بود.
کلمات کلیدي : کلزا، حفاظت انجمادي، شیشه اي شدن، PVS2
مقدمه:
کلزا گیاهی است یک ساله از خانواده چلیپائیان - Brassicaceae - با نام علمی - Brassica napus - ، در جنس براسیکا، کلزا مهم ترین دانه روغنی بوده که ارقام پاییزه آن در شرایط آب و هوایی معتدل، خنک و مرطوب بیشینه عملکرد تولید را دارد . - 1 - حفاظت انجمادي شامل نگهداري ژرم پلاسم در دراز مدت و دماي بسیار پایین می باشد که با کاهش و یا توقف فعالیت هاي متابولیکی همراه است. در این سیستم مشکلات مرسوم در نگهداري بذر مانند آسیب به DNA، نیاز به کنترل دوره اي، کنترل درصد پایایی و مشکلات محیطی و یا از دست رفتن بوسیله بیماري ها کاهش یافته یا از بین می رود . - 2 - حفاظت انجمادي بر روي بذر بسیاري از گونه ها انجام شده و در برخی موارد جوانه زنی غیر عادي و یا مرگ به علت آسیب هاي درونی گزارش شده است.
اي مشکلات اغلب به دلیل خصوصیات بذر مانند اندازه، رطوبت و ترکیبات شیمیایی بوده است . - 3 - براي حفاظت انجمادي بافت هاي گیاهی بطور وسیعی از محلول PVS2 استفاده شده است که توسط ساکاي و همکاران در سال1990 ارائه شد که داراي پتانسیل بالایی در حفظ بافت هاي گیاهی می باشد. حفاظت انجمادي می تواند در نیتروژن مایع و یا فاز گازي این ماده انجام شود که براي جلوگیري از شکل گیري کریستال هاي یخ نمونه ها بایستی در دمایی پایین تر از -130 قرار گیرند . - 4 - براي بازیابی نمونه ها معمولا از ذوب سریع در آب 40-35 درجه سانتیگراد استفاده می شود تا امکان تشکیل دوباره کریستال و آسیب به بافت به حداقل برسد.
مواد و روش ها
در این آزمایش از بذر هاي دو ژنوتیپ گیاه کلزا به نام هاي ARC-2 و MILENA براي یافتن روش مناسب جهت حفاظت ژرم پلاسم این گیاه استفاده شد. بذر ها به تعداد 40 عدد پس از شستشو و خشک شدن در دماي اتاق به ویال هاي انجمادي 2ml منتقل شدند سپس مورد تیمار با محلول هاي حفاظت کننده قرار گرفتند. محلول هاي استفاده شده دو محلول پر کاربرد در حفاظت انجمادي بافت هاي گیاهی به نام هاي PVS2 و PVS3 بودند .محلول PVS2 شامل %30 گلیسول، 15 درصد اتیلن گلایکول، %15 دي متیل سولفوکساید با زمینه محیط کشت مایع MS و محلول PVS3 شامل %40 گلیسرول و % 40 ساکارز می باشد - . - WV تیمار ها در دماي اتاق و با 5 سطح زمانی براي آبگیري شامل20، 40، 60، 80، 100 دقیقه بود. پس از اتمام زمان تیمار محلول ها از ویال ها خارج شده و محلول تازه به میزان0.5 ml در ویال ها ریخته شد. درب ویال ها بسته شد و مستقیما در نیتروژن مایع قرار داده شدند. زمان ماندن نمونه ها در نیتروژن مایع 20 ساعت بود.
پس از این مدت ویال ها از نیتروژن مایع خارج شدهو در آّب با دماي 40 درجه در بنماري قرار داده شدند تا دما به سرعت افزایش یابد. پس از 10 دقیقه ویال ها از بن ماري خارج شدند و به مدت 30 دقیقه در دماي اتاق قرار داده شدند. در مرحله بعد محلول هاي حافظت کننده از ویال ها خارج شده و براي پاك شدن محلول هاي حفاظت کننده نمونه ها با یک محلول غلیظ که در اینجا محلول ساکارز 0.4 مولار بود شستشو داده شدند. بعد از این کار بذر ها با آب مقطر چند بار شستشو داده شدند و در نهایت در پتري دیش هاي 10 سانتیمتري بر روي کاغذ صافی کشت شدند و با آب مقطر تغذیه شدند. جوانه زنی بذر ها پس از 10 روز یادداشت برداري شد و طول ریشه چه و طول ساقه چه مورد اندازه گیري قرار گرفت. آزمایش در غالب CRD و بصورت فاکتوریل با سه تکرار انجام شد. تجزیه واریانس و مقایسه میانگین ها به روش دانکن براي سه صفت درصد جوانه زنی و طول ریشه چه و طول ساقه چه با استفاده از نرم افزار MSTAT-C انجام گرفت.
نتایج و بحث
نتایج حاصل از تجزیه واریانس داده ها نشان داد براي صفت درصد جوانه زنی دو فاکتور زمان و ژنوتیپ و اثر این دوفاکتور متقابل در سطح 0.01 و اثر متقابل زمان تیمار با نوع محلول هاي حفاظت کننده داراي اثر معنی دار در سطح0.05 بود. براي بررسی میزان موفقیت از دو صفت فیزیولوژیکی طول ریشه چه و طول ساقه چه استفاده شد که تغییرات در این دو پارامتر که بیشتر با کاهش طول ، کندي رشد و یا متوقف شدن زود هنگام بود نشانه اثرات سوء دماهاي بسیار پایین بوده و بالا بودن میانگین نشان دهنده موفقیت روش در تولید گیاهچه هاي سالم بوده است. براي
صفت طول ریشه چه دو فاکتور زمان و ژنوتیپ و اثر متقابل این دو فاکتور داراي اثر معنی دار در سطح 0.01 و اثر متقابل ژنوتیپ در نوع محلول و اثر متقابل سه گانه داراي اثر معنی دار در سطح 0.05 بوده است. همچنین براي صفت طول ریشه چه فاکتور زمان تیمار و اثر متقابل سه گانه در سطح 0.01 معنی دار بود - جدول . - 1
نتایج مقایسات میانگین ها به روش دانکن نشان داد براي صفت اصلی درصد جوانه زنی تیمار 100 و 60 دقیقه داراي بالاترین میانگین و داراي تفاوت معنی دار با سایر تیمار ها بودند و ژنوتیپ MILENA داراي میانگین بالاتر و اثر متقابل 120 دقیقه تیمار با محلول بر روي ژنوتیپ MILENA داراي تفاوت معنی دار با سایر اثرات متقابل بود. همچنین در اثرات متقابل نوع محلول با زمان تیمار با محلول سه تیمار زمان 120 دقیقه با محلول PVS2 و زمان 60 دقیقه با محلول PVS3 و20 دقیقه با محلول PVS3 داراي تفاوت معنی دار با سایر ترکیبات تیماري بود و بالاترین میانگین براي درصد جوانه زنی 120 دقیقه با محلول PVS2 به میزان 90 درصد بوده است - جدول. - 2
