بخشی از مقاله
چکیده
به منظور بررسی اثر شوری ناشی از کلرور سدیم بر الگوی پروتئینی کلزا - Brassica napus L. - ، دوازده رقم کلزای بهاره در مرحله رشد رویشی مورد ارزیابی قرار گرفتند. آزمایش در سه سطح شوری و در سه تکرار انجام گرفت. جهت بررسی الگوی پروتئینی با استفاده از تکنیک SDS-PAGE، نمونههای برگی چهار هفته پس از اعمال شوری و در پایان مرحله روزت تهیه شد. برای هر ژنوتیپ در هر سطح تنش سه نمونه پروتئین استخراج گردید و در سه تکرار نیز الکتروفورز انجام شد.
با بررسی الگوی پروتئینی بافت برگی به روش SDS-PAGE، 25 نوار با تکرار پذیری باال شناسایی گردید که از این بین 14 نوار چند شکل بودند. نوارهای چند شکل یا از تنش شوری متاثر شدند و یا منشا ژنتیکی داشته و اختالف بین ژنوتیپها را نشان دادند. نوار پروتئینی با وزن مولکولی 11/4 کیلودالتون تحت تنش شوری در تمام ژنوتیپها القا گردید و نوار پروتئینی با وزن تقریبی 54/9 کیلودالتون تحت تنش شوری تظاهر نیافت. از نوارهای چند شکل جهت گروهبندی ژنوتیپها استفاده گردید. تجزیة خوشهای داده های کیفی حاصل از الگوی پروتئینی ژنوتیپها انطباق باالیی با گروه بندی بر اساس داده های فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و زراعی از خود نشان داد.
مقدمه
دانه های روغنی بعد از غالت و حبوبات جایگاه سوم را در تامین نیازهای غذایی بشر بر عهده دارند 3 - - ، از طرفی گونه های روغنی متعلق به جنس براسیکا رتبه سوم را در بین دانه های روغنی به خود اختصاص داده اند.گیاهان به دلیل عدم تحرک در طول چرخه زندگی خود در معرض انواع تنشهای محیطی مانند خشکی، شوری، شرایط غرقابی، دماهای باال، پایین و... قرار میگیرند، که خسارات تنش های کمبود آب، شوری و گرما به گیاهان زراعی درجهان در مقایسه با سایر تنشهای محیطی گستردهتر است، که در این بین تنش های خشکی و شوری بیشتر مورد توجه قرار گرفته اند
گیاهان در پاسخ به این تنشها بیان برخی از ژنها را افزایش و برخی دیگر را کاهش میدهند. یک روش برای درک توانایی گیاهان برای تحمل تنشهای محیطی، بررسی وشناسایی تغییراتی است که در اثر تنش در سطح پروتئینهای خاص حاصل میشود. تغییر بیان ژن ها و تولید متابولیت های ثانویه در گیاهان در نتیجه تنش های محیطی به منظور کاهش پروتئین های خاص ساختاری یا آنزیمی در مسیرهای متابولیکی خاص است 7 - و . - 17 محصوالت ژنهای القا شده تحت تاثیر تنش را به دو گروه اصلی تقسیم میکنند 1 : - 17 - گروهی که بطور مستقیم گیاه را در برابر تنشهای محیطی محافظت می کنند.2 گروهی که بیان ژنها و اتصال عالمت در پاسخ به تنش را تنظیم میکنند.
بر اساس مطالعات انجام شده روی اثرات تنش شوری مشخص گردیده است که مقدار پروتئین محلول برگها در پاسخ به تنش کاهش و یا افزایش مییابد 15 - و . - 11 آگاستیان و همکاران - 1 - 1 گزارش کردهاند که در توت2، پروتئین های محلول تحت تأثیر شوری کم، افزایش در حالی که در شوری زیاد کاهش می یابد. تجزیه SDS-PAGE پروتئینهای بادام زمینی - Arachis hypogaea L. - توسط حسنین - 6 - 3 نشان داده است که گیاهان رشد کرده تحت شرایط شوری NaCl، واجد پروتئینهای 52 و 127 کیلو دالتونی و فاقد پروتئینهای 31 و 260 کیلودالتونی در سنتز چند پلیپپتید بودند.
در آزمایشات راماگوپال - 16 - شوری، 6 پروتئین جدید را در ریشههای جو با وزن مولکولی پایین و در محدودة 24 الی 27 کیلودالتونی و نقطة ایزو الکتریکی 6/1 الی 7/2 القاء کرد. در صورتی که، در قسمت هوایی منجر به سنتز پروتئین جدید با وزن مولکول 20 الی 24 کیلودالتون و نقطه ایزوالکتریکی 6/3 الی 7/2 گردید. یکی از روشهای بررسی الگوهای پروتئینی مبتنی بر الکتروفورز 4 SDS-PAGE میباشد که یک روش کم هزینه، سریع و تکرارپذیر در مطالعه پروتئینها است.
بیشترین مورد استفاده از این سیستم تعیین وزن مولکولی پپتیدها است که با استفاده از پروتئینهای استاندارد با وزن مولکولی مشخصی می توان وزن مولکولی پلیپپتید مجهول را تخمین زد - . - 14 البته تحقیقات زیادی در زمینه استفاده از تکنیک SDS-PAGE برای بررسی الگوهای پروتئینی گیاهان تحت تنش نیز صورت گرفته است. در مقایسه الگوهای پروتئینی گیاهان شاهد با گیاهان واقع در شرایط شوری، پلیپپتیدهایی قابل شناسایی هستند که افزایش، کاهش، ظهور و ناپدید شدن آنها با اعمال شوری مشاهده میشود
در گونههای مختلف گیاهی، کاهش در سطح پروتئینهای بخشهایی از گیاه که تحت تأثیر شوری قرار دارند به کاهش در ساخت پروتئینها و آنزیمهای دخالت کننده در ساخت اسیدهای آمینه و پروتئینها، نسبت داده شده است. همچنین افزایش سطح پروتئینها در اثر شوری نتیجه افزایش ساخت پروتئینهای قبلی و تعدادی از پروتئینهای جدید است که در ایجاد تحمل به تنش شوری در گیاه نقش دارند. این پژوهش جهت بررسی تاثیر تنش شوری بر الگوی پروتئینی بافت برگی ارقام بهاره کلزا در مرحله رشد رویشی با استفاده از تکنیک SDS-PAGE طراحی و اجرا گردید.
مواد و روش ها
در این پژوهش دوازده رقم کلزای بهاره به اسامی Olga، Wild Cat، Sorigol، Heros، Cracker، Option500، Comet، Hyola308، Amica، Eagle، SW500l و RGS003 تحت تاثیر تیمار شوری به صورت کرتهای خرد شده با طرح پایة بلوکهای کامل تصادفی با سه تکرار قرار گرفتند. شوری از نوع کلرورسدیم در سه سطح صفر - شاهد - ، 175 و 350 میلیمول و در محیط کشت هیدروپونیک اعمال گردید.
یک هفته پس از انتقال گیاهچهها به بستر کاشت تنش شوری به صورت تدریجی و طی 3- 5 روز متوالی بسته به سطح شوری اعمال گردید. جهت بررسی تغییرات الگوی پروتئین ها، 4 هفته پس از اعمال شوری و در پایان مرحله روزت و قبل از شروع مرحله ساقه دهی نمونه هایی از برگها داخل فویلهای آلومینیومی بستهبندی و داخل تانک ازت مایع به آزمایشگاه منتقل و در فریزر 10°C نگهداری شدند.
این کار برای تازه نگه داشتن بافت برگی و جلوگیری از فعالیت پروتئازها انجام گرفت . برای استخراج پروتئینهای کل محلول در آب و نمک، مقدار 0/5 گرم از هر نمونه برگی در داخل هاون چینی قرار داده شد و محلول بافر استخراج و 1 میکرولیتر 2 مرکاپتواتانول به آن اضافه و کامالً له گردید و پس از آن درون میکروتیوب 1/5 میلیلیتری ریخته شد. سپس نمونه ها به مدت 30 دقیقه داخل فریزر 20°C قرار داده شدند. پس از رسیدن نمونه ها به دمای 4 درجة سانتی گراد در دور 15000rpm به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند. بعد از سانتریفیوژ قسمت مایع زالل فوقانی جدا شد و بار دیگر مجدداً با شرایط ذکر شده قبلی سانتریفیوژ شد. بعد از برداشت محلول زالل فوقانی نمونة نهایی به دست آمده در فریزر20° C نگهداری گردید. از این محلولها برای تعیین و بررسی الگوی پروتئین برگها با استفاده از تکنیک SDS– PAGE مبتنی بر روش الملی استفاده گردید.
به منظور مقایسه الگوی پروتئینی ژنوتیپها درشرایط عادی، تنش مالیم و شدید شوری از ابتدا تا انتهای حرکت نوارها در ژل از شماره 1تا شماره 100 تقسیم بندی شد. سپس نوارها با دقت یکی میلیمتر از هم متمایز شدند و با استفاده از نشانگر پروتئینی استاندارد، وزن مولکولی نوارها تعیین گردید. جهت گروهبندی ژنوتیپها با توجه به الگوی پروتئینی در شرایط عادی، تنش مالیم و شدید شوری بر اساس وجود یا عدم وجود نوار، به باندهای پروتئین حاصل از SDS-PAGE کدهای یک و صفر منظور شد و تجزیه کالستر با استفاده از روش UPGMA و بر اساس ضریب شباهت ژاکارد5 برای هر یک از سطوح تنش صورت گرفت. برای تعیین نقطه برش از تجزیه تابع تشخیص6 استفاده شد.
نتایج و بحث
برای هر رقم در هر سطح تنش سه یا چهار نمونه پروتئین استخراج گردید و در سه یا چهار تکرار نیز الکتروفورز انجام شد. نوارهایی که در دو یا بیشتر از دو ژل تکرار شده بودند نوار واقعی به حساب آورده شدند - شکل . - 1 شمارهگذاری نوارها بر پایه حرکت نسبی پروتئینها در ژل اصلی - RM × 100 - استوار بود . - 5 - بدین ترتیب 25 نوارمشخص و دارای تکرارپذیری باال جهت نتیجهگیری و تفسیر تعیین گردید. که از میان آنها 14 نوار پلیمورف در گروه بندی افراد از نظر بود و نبود نوارها مورد استفاده قرار گرفتند.
نوارهای 14، 17، 41، 43 و 49 نوارهایی بودند که در سطح شاهد یعنی محیط فاقد تنش در تمامی ژنوتیپها وجود داشتند ولی در محیطهای واجد تنش شوری در بین ارقام مختلف حضور یا عدم حضور آنها متفاوت بود. در واقع این نوارها پاسخ متفاوت ژنوتیپها به تنش شوری را نشان دادند . از طرف دیگر نوارهای 40 و 24 نوارهایی بودند که در سطح شاهد در هیچ کدام از ژنوتیپها مشاهده نگردیدند ولی در اثر اعمال تنش شوری در برخی از ژنوتیپها تظاهر یافتند.
نوار 11 به گونهای بود که در اثر تنش شوری در تمام ژنوتیپها القا گردید و در محیط فاقد تنش این نوار مشاهده نشد. نوار 36 در اثر تنش در تمام ژنوتیپها مشاهده شد ولی در محیط فاقد تنش در برخی ژنوتیپها مشاهده شد و در برخی دیگر دیده نشد. نوار شماره 19 در محیطهای تنشزا مشاهده نگردید ولی در سطح شاهد در برخی از ژنوتیپها وجود داشت و در برخی دیگر رویت نشد. نوارهای 3، 31، 69 و 72 برخالف سایر نوارها تنوع ژنتیکی بین ژنوتیپها را نشان دادند و به تنش شوری پاسخ ندادند.
به طور کلی نوارهای موجود را میتوان به سه گروه عمده تقسیم بندی نمود: دسته اول نوارهایی هستند که حالت مونومورف داشتند و در بین ژنوتیپ ها و سطوح مختلف تنش هیچ اختالفی را نشان ندادند. دسته دوم نوارهایی بودند که اختالف بین ژنوتیپها را نشان دادند و منشأ ژنتیکی داشتند. و دستة سوم نیز نوارهایی بودند که اثرات تنش بر روی ژنوتیپهای مختلف را نشان میدادند و تحت تأثیر تنش واقع شدند. در این آزمایش مشخص گردید که پلیپپتیدی با وزن مولکولی پایین 11/4 کیلودالتن - نوار شماره - 11 تحت شرایط تنش شوری در تمامی ژنوتیپها القا شد و میتوان اظهار داشت که این پلیپپتید نقش عمومی در ایجاد تحمل به تنش شوری داشته است.
نوار پروتئینی دیگری با وزن تقریبی 54/9 کیلودالتن - نوار شماره - 41 به شدت تحت تأثیر تنش شوری قرار گرفت، بطوریکه در اثر اعمال تنش تظاهر نیافت. البته این نوار در مورد رقم Olga استثنا بوده و تحت تنش شوری شدید در این رقم مشاهده گردید. گزارشهای بسیاری در دست است که ایجاد نوارهای پروتئینی جدید تحت تنش شوری یا مشاهده نشدن برخی از نوارها تحت تنش شوری را نشان دادهاند 16 - و . - 11 عالوه بر تأثیر تنش شوری بر روی الگوهای نواری پروتئینها از نظر بود و نبود یکی دیگر از تأثیرات مهم تنش شوری بر روی شدت تظاهر نوارهای مختلف میباشد که در بسیاری از مطالعات گزارش شده است
