بخشی از مقاله
چکیده
پژوهش حاضر به بررسی روشهای مختلف شکستن دیواره سلولی جهت استخراج و مقایسه لیپید کل در 4 گونه از ریزجلبکهای Spirulina platensis، Chloroccum sp.، Chlorella vulgaris، Symbiodinium sp. اختصاص یافته است. ریزجلبک های ذکر شده، از کلکسیون جلبک گروه زیست شناسی دریا، دانشگاه تربیت مدرس تهیه گردید و پس از حصول اطمینان از خالص بودن، اقدام به کشت آنها شد. ابتدا ارلن های حاوی جلبک، تحت دمای 25 ± ° 1C و شدت نوری 100 ʽmol.cm-2.s-1 در ژرمیناتور کشت داده شدند.
پس از رسیدن به مرحله رشد ایستایی، سانتریفوژ انجام شد و رسوب باقی مانده جهت خشک شدن به فریزداریر انتقال داده شد. جهت استخراج لیپید کل از روشهای التراسونیک، ماکروویو، انجماد، اتوکالوکردن، هموژناسیون استفاده گردید و درنهایت، میزان لیپید کل اندازهگیری شد. با توجه به شواهد، روش التراسونیک، در تخریب دیواره سلولها و استخراج لیپید کل در هر 4 گونه مورد مطالعه، بهترین نتیجه را نشان داد.
لیکن بیشترین مقدار لیپید کل در گونههای ریز جلبکی Spirulina platensis، Symbiodinium sp.، Chloroccum sp.و Chlorella vulgaris تحت پارامترهای اکولوژیکی کشت، به ترتیب به میزان 12/66، 17، 14/06، 10/92 درصد از وزن خشک محاسبه گردید، در این پژوهش، بیشترین میزان لیپید کل 17% - وزن خشک - به گونه.Symbiodinium sp اختصاص یافت. استخراج لیپید کل از ˂ریزجلبکها شدیدا تحت تاثیر روشهای انتخابی جهت تخریب و شکستن دیواره سلولی میباشد. وجود اختالف معنیداری - p 0/05 - بین روشهای اتوکالو ، انجماد، التراسونیک، هموژناسیون و ماکروویو در این مطالعه نشان داد که، میزان لیپید استخراج شده براساس روشهای مختلف شکستن دیواره سلول، متفاوت میباشد.
مقدمه
Symbiodinium sp. با دیواره سخت از جنس سلولز ریز جلبک ها در آبهای کم عمق شفاف و ناحیه جزرومدی درمعرض آسیب اشعه فرابنفش خورشید قراردارندکه توانستهاند با تولید مواد زیست فعال به این محیط سازگار شوند . - Awai et al., 2012 - از جمله این متابولیتها می توان به استروئیدها، ترپنوئیدها، ایزوپرنوئید، ترکیبات نیتروژنی، ترکیبات سولفور، لیپیدها و اسیدهای چرب اشاره نمود - Rastogi et al., . - 2010, Shick and Dunlap., 2002 ترکیبات لیپیدی شامل لیپیدهای قطبی اند که بطور عمده فسفاتها و گلیکولپیدها میباشند و لیپیدهای غیرقطبی یا خنثی ازجمله آسیل گلیسرول، استرهای مومی و غیره هستند که تحت تاثیر متغیرهای محیطی مانند شدت و دورههای نوری، درجه حرارت، شوری، مرحله رشدی و غیره تغییر مییابند.
2012 لیپید ریزجلبکها پتانسیل باالیی برای داروسازی، صنایع شیمیایی و مواد غذایی دارند . - Solovchenko., 2012 - روش شکستن دیواره سلول به دو روش انجام میشود. روش اول مکانیکی مانند هموژناسیون، امواج التراسویک، اتوکالوکردن و غیره میباشد و روش دوم غیر مکانیکی از جمله انجماد، تیمارهای شیمیایی مانند اسیدو باز، استفاده از حالل- های آلی وغیره هستند - Chisti and Moo-Young., . - 1989 تعیین یک روش مناسب برای شکستن سلول بهمنظور بهروری باالی لیپید و افزایش کیفیت و میزان محصول بسیار تاثیرگذار می باشد.
هدف از این پژوهش مقایسه روشهای مکانیکی و غیر مکانیکی شکستن دیواره سلولی در چهار ریزجلبک با ساختار دیوارهای مختلف است. لیکن دستیابی به مناسبترین روش برای شکستن سلول ریزجلبکها به-منظور به دستآوردن حداکثر غلظت لیپید کل و بهبود کیفیت استخراج لیپید یکی از ارکان مهم در پژوهش حاضر میباشد. لذا از ریز جلبک سبزآبی Spirulina sisnetalp با دیوارهای از جنس پپتیدوگلیکان، وجلبکهای سبز یوکاریوتی Chlorococcum sp. و Chlorella vulgaris با دیواره سخت سلولزی استفاده شد.
مواد و روشها
ریزجلبکهای Spirulina platensis، Symbiodinium sp.، Chlorococcum sp. و Chlorella vulgaris ابتدا از کلکسیون جلبک گروه زیستشناسی دریای دانشگاه تربیت مدرس تهیه شد. جهت کشت ریزجلبکها ابتدا در ارلن مایرهای 200 میلی لیتری و سپس در ارلن مایرهای 2 لیتری کشت شدند. تراکم سلولها برای شروع کشت با تلقیح 20×104 سلول در میلیلیتر، تراکم سلولی اولیه آنها تنظیم شد، سپس ارلنها در ژرمیناتور ها تحت دمای 25 ± 1 C و شدت نور µ 100mol.cm-2.s-1 کشت شدند.
سپس سوسپانسون آنها سانتریفوژ شد و رسوب باقی مانده جهت خشک شدن به فریزداریر انتقال داده شد - Zarei Darki et . - al., 2017 جهت استخراج لیپید کل از روشهای التراسونیک، اتوکالوکردن، منجمدکردن، هموژناسیون و ماکروویو جهت شکستن سلول ها استفاده شد. در این پژوهش پنج روش متداول شکستن دیواره سلول مورد بررسی قرار گرفت، به این صورت که 0/05 گرم نمونه خشک جلبکی مورد نظر را وزن نموده و به آن 4 میلی-لیتر آب مقطر جهت جذب رطوبت افزوده شد. در مرحله بعد محلولی شامل دو حالل متانول و کلروفرم 1:2 - - v/v حل شد. پس از ورتکس به نمونهها 5 میلیلیتر کلروفرم اضافه شد و بعد از چند دقیقه 5 میلی لیتر محلول کلرید سدیم % 0/9 اضافه گردید.
پس از دو فاز شدن، نمونهها را به ظرفهای دکانتور منتقل و پس از 12 ساعت، فازها در ظرف دکانتور تشکیل شد. سپس سطح محلولها در ظرفهای ارلن با افزودن کلروفرم یکسان شدند. درنهایت کلروفرم تبخیر و در آون در دمای 80 درجهسانتیگراد به مدت 1/5 ساعت قرار داده شد تا کامل خشک شدند. ظرف حاوی رسوب را توزین و سپس درصد لیپید کل محاسبه گردید - Bligh and Dyer., 1959، Rodríguez-Troncoso, et al., 2010 و . - Zheng, et al., 2011
روشهای شکستن سلول
در این پژوهش از دستگاه التراسونیکاتور در روش التراسونیک به مدت 15 دقیقه استفاده شد. در روش اتوکالو کردن نمونهها در دمای 121 درجهسانتیگراد به مدت 5 دقیقه با فشار 1/5 بار در دستگاه اتوکالو قرار گرفتند. بنابراین در اثر حرارت و فشار باال سلولها کامال تخریب میشوند. در حالی که روش ماکروویو در اثر حرارت باالی ایجاد شده توسط دستگاه ماکروویو باعث تخریب دیواره سلول میشود.
در این روش نمونهها به مدت 3 دقیقه و دمای 90 درجهسانتیگراد در ماکروویو قرار داده شد. با استفاده از دستگاه هموژنایزر دستی در روش هموژناسیون به مدت 2 دقیقه، نمونه ها کامالً هموژن شدند. قابل ذکر است در روش منجمد کردن سلولها در اثر انجماد بزرگتر میشوند، زیرا انجماد باعث تشکیل بلورهای یخ در داخل سلول ها میشود. هر چه سرعت انجماد آهسته تر باشد سلولهای بزرگتری ایجاد و دیواره سلول ها آسیب بیشتری می-بیند، لذا نمونهها در دمای -20 درجهسانتیگراد به مدت یک شب قرار داده شد. Lee et al., 2010 - و . - Zheng, et al., 2011
نتایج
طبق نتایج بدست آمده در پژوهش حاضر مقدار لیپید کل استخراج شده دربین روشهای مختلف شکست دیواره سلولی در هر چهار گونه˂ ریز جلبک، اختالف معنیداری در سطح - 0/05 p - مشاهده شد. آزمون - Kolmogorov-Smironov - نرمال بودن دادهها را در تمام روشهای شکستن سلول در هر چهار گونه ریز-جلبک نشان داد. نتایج آماری میزان درصد لیپید استخراجی با روشهای مختلف شکستن سلول از 4 ریزجلبک مذکور در شکل 1 آمده است.
بیشترین مقدار لیپید کل استخراج شده در هر 4 ریزجلبک از روش التراسونیک بدست آمد. مقایسه مقدار لیپید استخراج شده با روشهای شکستن سلول در Symbiodinium sp. نشان داد که روش هموژناسیون کارایی مشابهای با اتوکالوکردن، و همچنین روش ماکروویو با روش انجماد داشت. مقدار لیپید کل استخراج شده Spirulina platensis درروش امواج ماکروویو، هموژناسیون و انجماد کردن نتایج مشابهی را نشان دادند و نسبت به روش اتوکالو کردن کارایی بیشتری داشتند.
شکستن سلول با روش التراسونیک و اتوکالوکردن در گونه Chlorococcum sp. کارایی مشابهی داشت و در بین تمامی روشهای مقایسه شده، بیشترین میزان لیپید توسط این دو روش بدست آمد. از طرفی بین روشهای ماکروویو و انجماد کردن تفاوت معنیداری مشاهده نشد. با این وجود، نسبت به روش هموژناسیون کارایی کمتری داشت. ازبین روشهای شکست سلول در گونه Chlorella vulgaris بهترین روش بعد از التراسونیک اتوکالو کردن و انجماد میباشد. همچنین روش هموژناسیون کارایی مشابهی با روش انجماد نشان داد.
