بخشی از مقاله
چکیده
مطالب در طبیعت موجودات فراوانی یافت می شوند که ازانواع نورهاي فلورسانس و یا لومینوسانس در جهت اهداف مختلف همچون دفاع از خود و یا شکار استفاده می کنند. امروزه،لوسیفراز باکتریاي و لوسیفراز حشره شب تاب در طراحی و ساخت بسیاري از گزارشگرها و حسگرهاي زیستی کاربردهاي فراوانی داشته اند. کاربردهاي وسیعی از جمله آشکارسازي آلودگی ها در طبیعت تا اهداف پزشکی و درمانی براي اینگونه حسگرها در نظر گرفته شده است .
به منظور طراحی زیست گزارشگر عنصر مس،پروموترژن مقاومت به مس از اپرون COP که نقش مهمی را در باکتريPseudomonas syringae بازي می کند به همراه ناقل PGl3 که حاوي ژن اوسیفراز است بکارگرفته شدند. بدین منظور، پروموتو بعد از سنتز شدن،داخل سایتهاي بوش NheI و SacI وارد شده و ناقل هاي نوترکیب به داخل باکتري E.coli BL-21 انتقال داده شدند. در نهایت، سنجش لوسیفراز براي گزارشگر طراحی شده در حضور غلظتهاي مختلف سولفات مس افزایش فعالیت نشان داد. سنجش لوسیفراز نمکهاي دو عنصر آهن و روي نیز جهت مشخص کردن اختصاصی بودن گزارشگر طراحی شده انجام گرفت که هیچگونه واکنشی را نشان داد.
مقدمه
از گذشته هاي دور تجهیزات بسیاري از جمله اسپکترومتري،گاز کروماتوگرافی جومی و یا HPLC جهت تشخیص،آشکارسازي و باز بینی آلودگیهاي آلی و غیرآلی که محیط زیست و انسانها را تهدید می کنند،کاربرد داشته اند - . - 2 اما تمامی آن تجهیزات داراي مشکلاتی بودند که موجب شد نسل جدیدي از فن آوري که هم سریع بوده و هم دقت فراوانی را دارد بوجود آید. گزارشگرها و یا حسگرهاي زیستی نوعی از باکتري ها هستند که توانایی ساخت و سنتز پروتئینهایی را داشته که جهت تشخیص اهداف شیمیایی و یا فیزیکی بکار گرفته می شوند.
این گزرشگرها حاوي یک سیستم ژن تنظیمی - پروموتر - به همراه ژن گزارشگر بوده که در حضور مواد مختلف پروتئینی راکد کرده که نورهاي فلورسانس و یا لومینوسانس از خود ساطع می کنند. این دسته از حسگرها حساسیت بالایی در حدود 0.1 ماکروگرم تا 0.1 میلی گرم داشته، لذا بسیار مناسب جهت ردیابی ماکرومولکولها و مواد سمی و یا تشخیصهاي پزشکی می باشند - . - 5 مس متعلق به خانواده خاصی از فلزات می باشد که براي بسیاري از باکتریها کشنده بوده و آنها را وادار به سنتز آنزیمهاي مختلفی از جمله سیتوکرم C اکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز می کند.
همجنین باعث بیماریهاي خاص از جمله سندرم منکز و بیماري ویلسون می شود. - - 1 بعلاوه مس بعنوان آفت کش براي جلوگیري از طیف خاصی از ریز جانداران کاربرد دارد.درنتیجه در چند سال اخیر تعدادي از این موجودات که در طبیعت نسبت به این عنصر مقاومت نشان داده اند مشاهده شده است مانند E.coli و Pseudomonas syringae pv.tomato به منظور طراحی و ساخت زیست گزارشگر عنصر مس ، از پرومتراپرون COP که مسئول سنتز پروتئین مس در باکتري P.syringae در غلظتهاي بالاي این عنصر در محیط می باشد استفاده شد - . - 4
مواد و روشها
پروموتورژن مقاومت به مس از اپرون COP که در ناقلpPT23D باکتري P.syringae اتخاب و توالی آن ستتز شد. طول این توالی 172 نوکلئوتید می باشد. بعنوان ناقل،پلاسمید PGL3 که حاوي ژن لوسیتواز و تعداي توالی سایت بوش می باشد برگزیده شد.. با توجه به توالی بوش،دو آنزیم بوش SacI و XhoI در ابتدا انتخاب و توالی آنها در سنتز پروموتور در نظر گرفته شدند،ولی بعد از آزمایشات مشخص شد که XhoI آنزیمی مناسب نبوده، لذا آنزیم NheI جایگزین شده و دو پرایمرکه پرایمر معکوس حاوي توالی سایت بوش این آنزیم می باشد طراحی شدند.
سپس PCR گرادیان صورت گرفته و دماي 61.7 درجه سانتیگراد مطلوب قرار گرفت . سپس مراحل هضم آنزیمی پروموتور مورد نظر و ناقل و بعد از آن اتصال مجدد و در نهایت انتقال به سلولهاي E.coli XL1-Blue که کارایی بالایی در مراحل انتقال دارند به ترتیب صورت پذیرفت. به منظور اطمینان از کلیه مراحل طراحی، کلونی PCR و بعد از آن هضم آنزیمی توسط آنزیمهاي محدودگر و در نهایت توالی یابی پروموتور وارد شده به پلاسمید نوترکیب PGL3 متعاقبا" اجرا شد.
در آخرین مرحله سنجش لوسیفراز براي باکتري نوترکیب - گزارشگر زیستی عنصرمس - در غلظتهاي مختلف سولفات مس - - CuSO4.5H2O نیاز بود.بنابراین پلاسمید نوترکیب به باکتري E.coli B-21 که کارایی بهتري در بیان پروتئین دارد انتقال ، در محیط کشت LB رشد و غلظتهاي متفاوتی از عنصر مس به محیط اضافه شد و تمامی فالکونها در دماي 37 درجه به مدت 4 ساعت گرماگذاري شد. این مراحل براي نمکهاي عناصر آهن و روي Fe2 - SO4 - 3.5H2Oو ZnSO4.H2O تکرار شد تا از انحصاري بودن گزارشگر طراحی شده اطمینان حاصل شود. بوسیله دستگاه جذب اتمی غلظتهاي مختلف سولفات مس جهت تائید دقت محلولهاي ساخته شده اندازه گیري شدند.
نتایج
با توجه به آزمایشات قبلی، دماي مناسب براي PCR گرادیان 61.7 درجه سانتیگراد می باشد . بنابراین PCR در آن دما صورت گرفته و بعد از خالص سازي از ژل اکترونورز،محصول - PCRپروموتور موردنظر - و ناقل ها مورد هضم آنزیمی با آنزیمهاي SacI و NheI قرار گرفته و بعد از آن اتصال بوسیله آنزیم لیگاز صورت گرفت. بعد از انتقال به باکتري E.coli باکتریها در محیط LB رشد داده شده و ظاهر شدن کلونیها مراحل نوترکیب سازي را ثابت نمود.
بحث و نتیجه گیري
در سالهاي اخیر،تحقیقات بسیاري در زمینه طراحی و تولید حسگرها و گزارشگر هاي زیستی به منظور تشخیص فلزات،آلودگیها و یا مواد سمی در محیط زیست صورت گرفته است. پیش از این تحقیق،تلاشهایی جهت طراحی زیست گزارشگر براي عنصر مس انجام شده اما نه به اندازه اي که براي دیگر فلزات از جمله کادمیوم،آرسنیک،روي و........تلاش شده است. دیوید هولمز حسگري را براي عنصر مس با انتقال ژن lux بعد از پروموتر تنظیمی عنصر مس جدا شده از باکتري E.coli تولید کرد - . - 3اما در این پروژه لوسیفراز از حشره شب تاب و پرومتر مقاومت به مس ازP.syringae pv.tomato بکار برده شدند که یک روش جدید به حساب می آیند.
