بخشی از مقاله
چکیده
در این ﲢقیق به منظور غربال ژنوتیپ های مقاوم به ریزومانیا، از کلون های حاصل از کشت بافت چغندر قند استفاده گردید. برای این کار، ابتدا ریزﳕونه حاصل از کشت جوانه راسی گیاهچه بذری چغندرقند پس از ضد عفونی سطحی به ﳏیط رشد جوانه رویشی منتقل گردید. سپس جوانه های رشد کرده به ﳏیط های کشت حاوی ترکیبات ﳐتلف هورمونی NAA ، BA ، IBA و GA3 جهت تکثیر، رشد و ریشه زائی جوانه منتقل شدند.
کلون های حاصل سپس به خاک انتقال داده و به شرایط ﳏیطی گلخانه سازگار شدند. سپس به منظور غربال کلون ها نسبت به بیماری ریزومانیا، تعدادی ژنوتیپ ازکلون ها ی سازگار شده انتخاب و آزمایش تلقیح کلون ها با خاک آلوده به بیماری ریزومانیا اجرا گردید. برای این کار، گیاهان سازگار شده از گلدان ها خارج شده و در گلدان جدید حاوی ماسه و خاک آلوده به ریزومانیا به نسبت 3:7 منتقل گردیدند.
پس از 2 ماه از تلقیح با خاک آلوده به منظور تشخیص آلودگی ارقام به ویروس عامل بیماری و نیز تعیین میزان آلودگی، آزمون الایزا به کار گرفته شد. این آزمون به روش مستقیم - DAS-ELISA - اﳒام شد. در این ﲢقیق میزان مقاومت با عصاره گیاه ساﱂ سنجیده شد. سپس اعداد قرائت شده الایزا مورد ﲡزیه آماری قرار گرفتند. بین ژنوتیپ ها و بین بلوک ها تفاوت معنی دار مشاهده گردید. از ژنوتیپ های مورد آزمایش ژنوتیپ های RB-45 مقاوم و RB-13 متحمل و مابقی حساس تعیین گردیدند.
مقدمه و اهداف
در حال حاضر ریزومانیا1 از مهمﱰین و ﳐرب ترین بیماری های چغندر قند ﳏسوب می شود که خسارت آن معمولاً بیش از 30 درصد و در مواردي به 90 تا100درصد در ارقام حساس می رسد - . - 7 بیماري ریزومانیا در اغلب مناطق چغندر آاري اروپا، آسیا و آمریکا گزارش شده است . - 6 - در ایران هم در سال 1374 وجود این بیماري در مزارع چغندر قند استان فارس مشاهده و تا آنون از اآثر نقاط چغندر آاري آشور گزارش گردیده است - . - 1 عامل این بیماري، ویروس زردي نکروتیک رگﱪگ چغندرقندBNYVV2 می باشد آه توسط قارچ خاآزادپلی میکسا3 به چغندرقند منتقل می گردد . - 11 - نظر به اینکه آنﱰل بیماري به روش هاي زراعی، شیمیایی و بیولوژي چه از نظر اقتصادي و چه از نظر زیست ﳏیطی و اجتماعی موثر نبوده و شدنی نیست .
مواد و روش ها
مواد گیاهی مورد استفاده در این آزمایش یک توده بالک بذری تﱰاپلوئید چغندر قند بود که دارای والدین مقاوم نسبت به ریزومانیا می باشد. این بذور به روش مرسوم آزمایشگاه کشت بافت ضد عفونی سطحی شده، درون ظروف شیشه ای حاوی آب آگار کشت وسپس جوانه های راسی گیاهچه های بذری 2 هفته سن، جدا سازی شده و در ظروف پﱰی حاوی ﳏیط پایه MB شامل املاح - 10 - MS و ویتامین های - 3 - B5 دارای ترکیبات هورمونی BA و GA3 با غلظت های 0/5 و 0/01 میلی گرم در لیﱰ جهت رشد طولی جوانه کشت گردیدند.
به منظور تکثیر جوانه های حاصل از مرحله قبل پس از 2 تا 3 هفته جوانه های رشد یافته به ﳏیط جدید BIN حاوی ترکیبات هورمونی BA، NAA و IBA به ترتیب با غلظت های 0/5، 0/1 و 0/1 میلی گرم در لیﱰ منتقل و پس از 2 تا 3 هفته جوانه های باززائی شده جدا شده و به ﳏیط MB فاقد هورمون جهت رشد طولی انتقال یافتند. جوانه های با ارتفاع 5 تا 7 سانتیمﱰ از ﳏیطMB جدا و در ﳏیط ریشه زایی یا NI با ترکیبات هورمونی NAA و IBA با غلظت های 1/5 و 1/5 میلی گرم در لیﱰ قرار داده شدند . شرایط اتاقک رشد برای نگه داری ظروف کشت دارای 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و شدت نور 3 تا 4 هزار لوکس با دمای 22-24 درجه سانتیگراد بوده است.
به این صورت که گیاهان از گلداهنا خارج و پس از شستشوی ریشه ها به خاک آلوده به ریزومانیا با نسبت 3:7 به ترتیب ماسه اسﱰیل و خاک آلوده منتقل گردیدند و پس از 2 ماه از زمان تلقیح، ریشه های گیاهان خارج و پس از شستشو در پاکت های ﳎزا در -20°c تا زمان استفاده نگهداری گردیدند. در زمان الایزا، از هرﳕونه 0/1 گرم ریشه توزین و در 1/5 میلی گرم بافر عصاره گیری الایزا با دستگاه عصاره گیر له شده و روند آزمون الایزا به روش DAS-ELISA اﳒام گرفت. در هر پلیت 7 ﳕونه گیاه ساﱂ و یک ﳕونه گیاه آلوده به عنوان کنﱰل مثبت و منفی استفاده گردید سپس مقادیر جذب الایزا در 405 نانومﱰ بوسیله دستگاه الایزا قرائت گردید. داده های الایزا پس از تبدیل به ln - OD×15 - نرمال گردیده و ﲡزیه آماری و مقایسات میانگین دانکن در سطح احتمال 5 درصد روی داده ها با نرم افزار SAS1 اﳒام گرفت.
نتایج و ﲝث
آنالیزی که روی مقادیر جذب الایزا اﳒام شد اختلاف معنی دار در سطح یک درصد بین ژنوتیپ ها را نشان داد. که مورد انتظار بود، ﳘچنین اختلاف معنی دار در سطح بلوک ها یا تکرار مشاهده گردید که نشانگر اثرات ﳏیطی است که در اثر شرایط تلقیح با خاک آلوده، زمان انتقال و شرایط ﳏیطی بلوک های ﳐتلف و خطاهای آزمایشی در روند اﳒام آزمون الایزا می تواند باشد . با این حال روند غربال ژنوتیپ ها از دقت بسیار بالایی برخوردار بود زیرا ازهر ژنوتیپ، به تعداد 9 کلون ﳘسان ژنتیکی با خاک آلوده تلقیح و میزان مقاومت آن به صورت کمی مورد بررسی قرار گرفته است . طبق جدول 1 ، ژنوتیپ های اول تا یازدهم میانگین جذب ژتوتیپ های مورد غربال از نظر مقاومت به ریزومانیا بوده، ژنوتیپ 12 میانگین شاهد منفی کشت شده در خاک اسﱰیل، تیمار ﴰاره 13 مقدار جذب ﳕونه آلوده می باشد.
طبق جدول 1 ژنوتیپ گروه های A ، B ، C ، D ، E و F جزء ژنوتیپ های کاملا حساس قرار گرفته و ژنوتیپ های گروه های G جزء گروه متحمل و H که ﳕونه ساﱂ نیز جزء این گروه می باشد جزء ژنوتیپ های مقاوم قرار گرفت .پس در این ﲢقیق یک ژنوتیپ کاملا مقاوم با ﴰاره RB-45 و یک ژنوتیپ با ﴰاره RB-13 با سطحی از مقاومت به عنوان متحمل و بقیه جزء ژنوتیپ های حساس تعیین گردیدند.
در این ﲢقیق با توجه به تﱰاپلوئید بودن ژنوتیپ ها، طیف وسیعی از مقادیر جذب الایزا در ژنوتیپ های ﳐتلف دیده شد که می تواند به علت داشﱳ تعداد متفاوتی از آلل های مقاومت یا اثر دز ژنی بوده که مطابق با نتایج لولن و ﳘکاران - 8 - می باشد. از آﳒا که کلون های هر ژنوتیپ از نظر ژنتیکی ﳘسان می باشند و ارزیابی مقاومت بر اساس میانگین جذب 9 بوته کاملا یکنواخت ژنتیکی صورت گرفته است از این رو پدیده فرار از عامل بیماری که باعث مقاوم جلوه دادن ژنوتیپ های حساس می گردد کمﱰ می تواند اصلاحگر را در غربال ژنوتیپ های واقعا مقاوم به اشتباه اندازد. بنابراین غربال کلون های حاصل از کشت بافت در ارزیابی های مقاومت به بیماری از دقت بالاتری نسبت به روش های مرسوم غربال ژنوتیپ ها برخوردار است.
