بخشی از مقاله
چکیده:
رشد ونمو وباروي گیاهان از عوامل نامساعد محیطی از قبیل تنشهاي زنده و غیر زنده تاثیر معکوس می پذیرد. تنش سرما هر ساله خسارت زیادي را بر محصولات کشاورزي وارد میکند. بنابراین شناسایی عوامل ژنتیکی درگیر در تنش سرما و استفاده از این عوامل در جهت بهبود مقاومت گیاه در برابر سرما امري ضروي می نماید. گیاه نخود معمولی که در مناطق وسیعی از ایران بخصوص غرب و شمال غرب کشت و کار می شود یکی از سه لگوم مهم دنیا می باشد که به تنش سرمایی مقاومت بالایی نشان می دهد. در این تحقیق با استفاده از تکنیک cDNA-AFLP نیمرخ رونویسی در گیاه نخود معمولی مورد بررسی قرار گرفته است .
در این روش آر.ان.اي گیاه استخراج شده و در ادامه رشته اول و دوم دي.ان. اي از روي آن سنتز شد. پس از انجام فرآیند AFLP روي دي .ان.اي دو رشتهاي، قطعات ژنی نمونه تیمار که در مقایسه با نمونهي شاهد الگوي بیان متفاوتی داشت جداسازي شد. 92 قطعه با الگوي متفاوت از روي ژل آکریل آمید جداسازي و 54 عدد از آنها همسانه سازي و تعیین توالی شدند. با استفاده از برنامههاي بیوانفورماتیکی مانند Blastn و Blastx با توالیهاي EST موجود در بانکهاي اطلاعاتی مقایسه شدند. یافتهها نشان داد که %77/08 این قطعات کد کننده پروتئینهاي با اثرات شناخته شده میباشند و %22/91 نیز شباهت بالایی با توالیهاي ناشناس دارند. بعضی از قطعات شناخته شده در متابولسم سلول و برخی نیز در فرآیند انتقال پیام و سطح رونویسی گیاه شرکت دارند.
کلمات کلیدي: تنش سرمایی، نخود معمولی، تکنیک cDNA-AFLP،
مقدمه:
سرما، گرما، خشکی و شوري تنشهاي محیطی غیر زیستی محیط پیرامون گیاه میباشند که باعث ایجاد اثرات متنوعی روي رشد و باروري محصولات کشاورزي میشوند. این تنشها اولین عامل خسارت عمده در محصولات کشاورزي در سراسر جهان، کاهش متوسط عملکرد در حدود بیش از 50 درصد میشوند . - 1 - تنش سرمایی می تواند به طور مستقیم با جلوگیري کردن از انجام واکنشهاي متابولیسمی و به طور غیر مستقیم با القاء حالت اسموتیک - ممانعت از جذب آب در اثر سرمازدگی و هیدراسیون سلولی ناشی از یخ زدگی - ایجاد حالت اکسیداتیو و تنشهاي ثانویه دیگر از یبان شدن تمام پتانسیل ژنتیکی گیاه جلوگیري کند . - 2 -
فرآیند خوسرمایی فرآیندي است که گیاه به وسیله آن مقاومت لازم براي مقابله با یخ زدگی - در اثر قرار دادن گیاه در معرض دماهاي بالاتر از یخ زدگی - را بدست میآورد. اغلب گیاهان مناطق معتدله قابلیت خوسرمایی را داشته و از تشکیل یخ در فضاي خارج سلولی در داخل بافتهاي رویشی جلوگیري میکنند. فرآیند خوسرمایی ساختارهاي سلول و بافت را تغییر داده و بیان ژن و فرآیند متابولیسم را مجددا برنامه ریزي قرار میکند . - 3 - شواهد گواه بر آن است که حدود %5 درصد از تغییرات القاء شده توسط تنشهاي مختلف - سرما، خشکی و شوري - در سطح رونویسی مشابه میباشد . - 4 -
بخشی از پاسخهاي گیاه به تنش شامل تنظیم بیان ژن و همچنین تغییرات عمومی و اختصاصی در سطح رونویسی برخی از ژنهاي گیاه میباشد . - 5 - مقایسه تنشهاي سرما شوري و خشکی در سطح رونویسی - mRNA - نشان داده که تنش سرما ژنهاي خیلی بیشتري را القاء میکند . - 4 - در سطح ترجمه، 22 درصد از ژنهاي پاسخ دهنده فاکتورهاي رونویسی را کد میکنند و 10 درصد از آنها ژنهاي تنظیمی، پروتئین کینازها و فسفاتازها را کد میکنند . - 6 - گیاه نخود که در اکثر نقاط ایران کشت میشود مقاومت بالایی نسبت به سرما نشان میدهد. شناسایی این بنیانهاي ژنتیکی نقش موثر در بهبود محصولات کشاورزي خواهد داشت. براي بررسی سطح ترجمه در این گیاه از تکنیک cDNA-AFLP استفاده شد.
این تکنیک اولین بار در سال 1996 توسط باکم1 ابداع گردید و به طور گسترده در تحلیل نیمرخ رونویسی در گیاهان استفاده میشود 7 - و . - 8 تکنیک cDNA-AFLP یک روش انگشتنگاري RNA است که از - AFLP روشی براي انگشتنگاري - DNA منتج شده است. روشی با تکرارپذیري مناسب براي آشکارسازي رونوشتهاي با تظاهر متمایز است. به منظور برطرف کردن مشکلات مرتبط با روشهاي differential display و RAP-PCR که عمدهترین آن عدم تکرارپذیري و وجود تعداد زیاد باندهاي مربوط به خطاي مثبت - false positive - بود، این تکنیک - cDNA-AFLP - تحت شرایط PCR سختتر ابداع شد . - 7 -
الگوي باندي cDNA-AFLPتا حد بسیار زیادي تکرارپذیر و تقریبا عاري از باندهاي میباشد. تکنیک میکرواري نیاز به اطلاعات اولیه دارد اما این تکنیک نیاز به اطلاعات اولیه ندارد که بیانگر مزیت آن نسبت به میکرواري میباشد. به دلیل استفاده از پرایمرهایی که حاوي دو نوکلئوتید اضافی در انتهاي 3 خود هستند در واکنش PCR انتخابی در هر مرتبه انجام واکنش PCR تنها زیر مجموعهاي از قطعات cDNA تکثیر میشود. براي تکثیر کل جمعیت cDNA استفاده از کل ترکیبات ممکنه پرایمري ضروري است. محصولات تکثیري روي ژل پلیآکریلآمید واسرشت کننده تفکیک شده و بوسیله رنگآمیزي با نیترات نقره مشاهده میشوند . - 7 -
.مواد و روشها
به منظور تهیه بذر نخود معمولی از رقم فیلیپ 9393- - با نام تجاري آزاد - از مرکز تحقیقات ایلام استفاده شد.پس از کشت بذور و تولید گیاهچههاي سالم از طریق قرار دادن گیاهان در شرایط 4 درجه سانتی گراد به مدت هفت روز، فرآیند خوسرمایی روي آنها اعمال شد. در مدت زمان انجام فرآیند خوسرمایی، شرایط نور طبیعی - روز و شب - اعمال شد. گیاهان شاهد نیز در دماي معمولی در گلخانه پرورش یافتند. براي استخراج آر.ان.اي کلی گیاه از روش لیتیوم کلراید 2+ - Licl - استفاده شد . - Chang et al., 1993 - به منظور حذف DNA ژنومی از RNA استخراج شده تیمار آن با آنزیم DNase I انجام شد. رشته اول cDNA با استفاده از آنزیم M-MuLV شرکت Fermentas سنتز و رشته دوم cDNA با استفاده از آنزیم DNA polymeras I شرکت TaKaRa سنتز شد.
عمل هضم آنزیمی با استفاده از دو آنزیم برشی MseI و EcoRI انجام شد. سازگارسازها با استفاده از آنزیم T4 DNA ligase شرکت Fermentas به دو انتهاي قطعات برش یافته متصل شدند. مرحله پیشتکثیر3 با استفاده از آغازگرهاي coreE و coreM و شرایط PCR ي با 25 سیکل - 94درجه، 30 ثانیه، 50 درجه،1 دقیقه، 72 درجه 1 دقیقه - انجام شد. محصول این PCR ده مرتبه رقیق و با استفاده از آغازگرهاي حاوي دو نوکلئوتید انتخابی و 11 - Touchdown PCR سیکل از 63 درجه تا 53 درجه - - و در ادامه 25 سیکل 94 درجه، 30 ثانیه، 53 درجه، 45 ثانیه، 72 درجه، 60 ثانیه - براي تکثیر انتخابی قطعات به کار برده شد. جهت همسانه سازي محصول PCR از کیت Ins TA cloneTM PCR cloning شرکت Fermentas .استفاده شد. پایگاههاي اطلاعاتی موجود درسایت بیوانفورماتیکی NCBI شامل برنامههاي همردیف کنند توالیهاي Blastn - DNA و - Blastx و نیز توالیهاي EST در پایگاهاي مرتبط - TIGR - براي تجزیه و تحلیل این توالیها استفاده شد. از نرمافزار Vector NTI نسخه 9 براي تحلیل برخی از اطلاعات استفاده شد.
نتیجه و بحث:
از لحاظ تئوري تکنیک cDNA-AFLP میتواند بین دو ژن با بیش از 92 درصد همسانی تفاوت قائل شود. اختصاصیت، حساسیت و تکرار پذیري ویژگیهاي ممتاز این تکنیک است. بر اساس مطالعات، در بین روش هاي مختلف بررسی بیان ژن تکرار پذیري cDNA-AFLPاز همه بیشتر میباشد . - 9 - در این تحقیق 92 قطعه جداسازي شده و 54 تا از آنها کلون و سپس توالییابی گردید. مطالعات بیوانفورماتیکی نشان داد که %77/08 این قطعات کد کننده پروتئینهایی با عمل شناخته شده میباشند، که از این میان %33/33 از قطعات حاوي توالی کدکنندهي آنزیم ها و پروتئینهایی بودند که در متابولیسم و ساختار غشاء پلاسمایی گیاه نقش داشتند در حالیکه % 22/91 از قطعات کد کنند فاکتورهاي رونویسی و%20/83 مولکولهاي درگیر در فرآیند انتقال پیام - پروتئین هاي فسفواینوزیتول و کینازها - را کد میکردند. %22/91 از قطعات جداسازي شده نیز حاوي توالیهاي ناشناس بودند. اعمال پروتیینهاي منتج شده از این توالیها هنوز شناسایی نشده است و میتوانند به عنوان ژنهاي جدیدي که دیگران در تنش سرما گزارش نکردهاند نام برده شود.به ترتیب از چپ به راست، Total RNA، رشته اول cDNA، رشته دوم cDNA در که در فرآیند cDNA-AFLP باید به دقت استخراج وسنتز شوند.
