بخشی از مقاله
چکیده
یکی از روشهای مرسوم در شناسایی ارقام جدید، بهرهگیری از نشانگرهای مولکولی میباشد که به نوبه خود مستلزم صرف هزینه و آزمایشگاه مناسب است. بر این اساس روشهای مبتنی بر نشانگرهای مورفولوژیکی میتواند در صورت مختص به گونه بودن مفید باشند. در مرکبات، شکل بذر و ویژگیهای ریختشناختی آن میتواند به عنوان صفتی ارزشمند در شناسایی ارقام مورد استفاده واقع گردد.
در این پژوهش از 9 گونه و رقم مرکبات، شامل: گریپفروت، سیتروملو، کامکووات، لیمو شیرین، لیمو ترش، نارنگی انشو، نارنگی یونسی، نارنج سهبرگ، پرتقال سیاورز استفاده شد. از هر گونه و رقم تعداد 30 عدد بذر تهیه و سپس یکبار با انتگومان بیرونی و یکبار با انتگومان درونی عکسبرداری شد. هارمونیکهای فوریه بدست آمده از EFD تصاویر، توسط نرم افزار SPSS16 با روش CDA مورد تجزیه تحلیل قرارگرفت. نتایج حاصل از CDA شکل بذر مرکبات همراه با انتگمان بیرونی و انتگومان درونی به ترتیب بیانگر %89/6 و %84/4 بود. این یافته نشان داد که CDA شکل بذر مرکبات همراه با انتگومان بیرونی بهتر از انتگومان درونی برای شناسایی ارقام از طریق پردازش تصویر میباشد.
.1 مقدمه
مرکبات یک دسته مهم از تیره سداب - Aurantioideae - میباشند که به صورت گسترده در مناطق نیمه گرمسیری جهان کشت میشود.[2] تولید مرکبات در ایران نزدیک به هشتاد و هفت هزار تن برآورد شده است - سال - 2010 که رتبه دوازدهم دنیا را به خود اختصاص داده است . - FAO - در دهههای گذشته گامهای بلندی در صنعت مرکبات برای افزایش تولید و عملکرد برداشته شده است. بدون شک توسعه پایدار صنعت مرکبات وابسته به عرضه مداوم و بهبود ارقام جدید است که نیازمند اصلاح و معرفی ارقام جدید میباشد
ایران یکی از کشورهای مهم تولیدکننده مرکبات بشمار میآید و شناسایی، عرضه و معرفی ارقام جدید میتواند نقش مهمی در توسعه پایدار صنعت مرکبات در کشور داشته باشد. در این راستا شناسایی دقیق و مطمئن ژنوتیپها و ذخایر ژنتیکی بسیار ضروری خواهد بود.
یکی از روشهای مهم در شناسایی جانداران، بهرهگیری از تکنیکهای مولکولی، بویژه نشانگرهای مولکولی میباشد که به نوبه خود مستلزم آزمایشگاه مناسب و صرف هزینه بالایی است. روشهای مبتنی بر نشانگرهای مورفولوژیکی میتواند در صورت گونه اختصاصی بودن - species specific - آنها، مفید باشند. بسیاری از جنبههای شناسایی گیاهان، ساختار و ریختشناسی گیاه میباشد که آنها را گیاهشناسان در تحقیقات مورفولوژیکی مورد استفاده قرار میدهند. مفیدترین ویژگی این روش این است که معمولا تصویری دو بعدی از اندام گیاهی میدهد
یکی از صفات مهمی که بهعنوان شاخص ارزیابی و تفکیکی گونه و رقم در مرکبات مورد استفاده قرار میگیرد، مورفومتری شکل بذر است. در مرکبات، شکل بذر و ویژگیهای ریخت شناختی آن میتواند بهعنوان صفتی ارزشمند در شناسایی ارقام مورد استفاده واقع گردد .[2] بذر مرکبات گونه- اختصاصی بوده و کمتر به عوامل درونی و بیرونی وابستگی نشان میدهند و به دو بخش انتگومان بیرونی - Testa - و انتگومان درونی - Teghman - تقسیم میشود که ریختشناسی تستا با توجه به داشتن بخش تخت - بال بذر - وشکل هندسی ویژه، مورد توجه است .[34] با اینحال، کمتر پژوهشی بر اساس روشهای آنالیز تصویری برای استفاده از مورفومتری بذر مرکبات بهعنوان نشانگر مورفولوژیکی برای شناسایی گونه و رقم انجام گرفته است.
امروزه آنالیز تصویر کاربردهای وسیعی در کشاورزی دارد که میتوان به برداشت میوه توسط ماشینهای برداشت مجهز به چشم الکترونیک از طریق آنالیز تصویر میوههای نارس و رسیده [42]، درجهبندی سیب با روش تصویربرداری دیجیتالی و پردازش تصاویر [21]، تعیین نوع قند خرما - گلوکز، فروکتوز، ساکارز - از روی شدت رنگ میوه خرما [12]، تعیین غلظت کلروفیل [4]، تعیین مقدار سرمازدگی در انبار [15] و ارزیابی بیماریهای قارچی و آسیبهای بافتی ناشی از آن [40]، اشاره نمود. هدف از آنالیز تصویر در این پژوهش توسعه یک سیستم شناسایی آماری براساس تکنیک آنالیز تصویر که قادر به شناسایی و طبقه بندی برخی از واریته های مرکبات و مقایسه بین ارقامیباشد.
نرم افزار Shape در واقع بسته برنامه کامپیوتر برای ارزیابی کمی اشکال زیستی بر اساس توصیف فوریه بیضوی - Elliptic Fourier Descriptor - EFDs میباشد. ارزیابی کمی شکل اندامهای زیستی که اغلب در زمینههای مختلف پژوهشی مانند کشاورزی، پزشکی، ژنتیک، بوم شناسی و ردهبندی مورد نیاز است، توسط این نرم افزار صورت میگیرد. کمی کردن شکل برای ارزیابی نحوه توارث صفات مورفولوژیکی در ژنتیک کمی یک پیش شرط است.
در بسیاری از مطالعات نشان دادند که اندازه گیری بر اساس EFDs، برای کمی کردن شکل اندامهای گیاهی و جانوری مفید میباشد. استفاده از روش ارزیابی شکل بر اساس EFDs می تواند یک ابزار قدرتمند برای تجزیه و تحلیل شکل بیولوژیکی باشد. اما استفاده از این روش برای یک پژوهشگر آسان نیست به دلیل اینکه شامل چندین رویه پیچیده، مانند پردازش تصویر، ضبط کنتور - شکل بسته - ، استخراج داده از توصیف، وتجزیه و تحلیل چند متغیره از توصیف است. در واقع نرمافزار Shape بر پایه توصیف فوریه بیضوی - EFDs - میباشد.
.2 مواد و روشها نمونهبرداری و آمادهسازی نمونهها:
این آزمایش در آزمایشگاه ارگانوژنزگروه باغبانی، واقع در ساختمان شماره 2 دانشکده کشاورزی دانشگاه تبریز اجرا شد نمونههای بذر مرکبات ازایستگاه کترا وابسته به مرکز تحقیقات مرکبات ایران تهیه شد. در این پژوهش از 9 گونه مرکبات استفاده شد که عبارتند بودند از: -1 گریپفروت -2 سیتروملو -3 کامکووات ناگامی -4 لیموشیرین -5 لیموترش -6 نارنگی انشو -7 نارنگی یونسی -8 نارنج سه برگ -9 پرتقال سیاورز، که از هر گونه تعداد 30 عدد بذر تهیه گردید.
عکسبرداری نمونهها:
عکسبرداری از نمونهها در طی 2 مرحله، یک بار با پوشش بیرونی و یک بار با پوشش درونی - پس از حذف لایه بیرونی بذر - در یک پس زمینه سیاه که شامل خمیر سیلیکونی سیاه رنگ بود، انجام گرفت. سپس با بهرهگیری از نور بدون سایه و هم محور در زیر استرومیکروسکوپ نیکون با دوربین 12 مگا پیکسل عکسبرداری شد. نمونهها توسط نرم افزار مخصوص عکسبرداری با کامپیوتر در اندازه 1024×768 در قالببندی TIF عکسبرداری شد.
آنالیز تصویر:
تابع الیپتیکال فوریه منحنیهای کاملاً مشابه تصاویر سیاه وسفید را در یک مجموعه دادههای همردیف از سطح دوبعدی را مورد مقایسه قرار میدهد. لذا در هر شکل بایستی نقاط شروع و پایان با شکل دیگر منطبق باشد. بنابراین آنچهکه در این روش بهعنوان ورودی آنالیز مد نظر قرار میگیرد، نقاطی با مختصات یکسان در مجموعهای از تصاویر برداشت شده است. لبه تصویر بذر پس از استخراج با استفاده از نرم افزار Shape ورژن 1/3 - بسته نرم افزاری برای آنالیز شکل بر اساس الیپتیکال فوریه - جهت ایجاد هارمونیهای تصویری - نقاط همسو با بیضوی استاندارد - تبدیل به توصیفگرهای فوریه میشوند. هارمونیها از 4 ضریب به ازای هر بذر تشکیل شده است. نرمافزار مورد استفاده بهصورت اتوماتیک تصاویر استخراجی را نسبت به میانگین هارمونیها نرمال میکند. که این کار با چرخاندن اشکال و قرار دادن آنها بروی نقاط صفر صورت میگیرد.
نرمالیته و هموژنیته هارمونیکهای بدست آمده از نرمافزار Shape ابتدا توسط تست Kolmogorov-Smirnov در نرمافزار SPSS16 مورد بررسی قرار گرفتند و سپس با روش آنالیز تشخیص کانونی - Canonical discriminate Analysis - شکل بذور مورد پژوهش با درصد بالایی گروه بندی شدند.
.3 نتایج وبحث
در این پژوهش از بذر 9 گونه و رقم مرکبات بهتعداد 30 عدد بذر تهیه و از هر بذر 2 بار عکسبرداری شد - یکبار با انتگومان بیرونی و یکبار با انتگومتن درونی - . عکسها بعد از ویرایش توسط نرم افزار Shape مبتنی بر تابع الیپتیکال فوریه به هارمونی تبدیل گردیدند. بر پایه این هارمونیها که گروهبندی را بر پایه CDA انجام میدادند، 9 گروه از نمونههای بذری مرکبات را بر اساس انتگومان بیرونی و درونی طبقهبندی شدند.
عکسهای گرفته شده از نمونهها توسط نرم افزار Irfan View ورژن 4/33 و ImageJ ویرایش شدند. ازآن جایی که تصاویر گرفته شده از نمونهها به دلیل وجود برخی از ناخالصیها اعم از وجود قارچها و رنگهای متفاوت در یک نمونه قابل استفاده برای آنالیز نبودند. بنابراین تصاویر ابتدا ویرایش شده و سپس بهصورت سیاه و سفید درآمدند. از آنجا که هدف در این پژوهش پردازش روی شکل بذور میباشد وآنالیز رنگ تصاویر مدنظر نیست تصاویر گرفته شده از نمونهها ابتدا توسط نرمافزار ImageJ بصورت باینری - سیاه و سفید - درآمدند، تا کار روی تصاویر بهراحتی انجام گیرد
با استفاده از قسمت اول نرم افزار Shape بنام Chain Coder تصاویر بذور به صورت کدهای زنجیرهای در آمدند، که این کدهای زنجیرهای در واقع جهتگیری نقاط مشخص شده روی شکل مورد نظر را نشان میدهند و به صورت یک بارکد مخصوص شکل بذر عمل میکنند. در مراحل بعدی این کدهای زنجیرهای مورد آنالیز و مقایسه قرار گرفتند.
شکل بذور مورد بررسی همراه با انتگومان بیرونی پس از نرمال شدن، چرخش و ویرایش توسط نرم افزار Shape مبتنی بر تابع الیپتیکال فوریه بهصورت شکل 2 درآمد، که در این شکل میانگین و انحراف معیار برای هر گونه و رقم مشخص شده است. این شکل میزان اختلاف در هر گونه و رقم را نشان میدهد. آنچه از شکل بر میآید، این است که بیشترین میزان اختلاف در گریپفروت با انتگومان بیرونی میباشد.
نتایج حاصل از گروهبندی تصویر بذور مرکبات هم با انتگومان بیرونی و هم با انتگومان درونی نشان داد که درصد تفکیک در گریپفروت با انتگومان بیرونی - %96,7 - بهتر از انتگومان درونی - %90 - ، در کامکووات با انتگومان بیرونی - %90 - بهتر از انتگومان درونی - %86,7 - ، در لیمو شیرین با انتگومان بیرونی - %90 - بهتر از انتگومان درونی - %76,7 - ، در نارنج سه-برگ با انتگومان بیرونی - %96,7 - بهتر از انتگومان درونی - %86,7 - و در پرتقال سیاورز با انتگومان بیرونی - %96,7 - بهتر از انتگومان درونی - %86,7 - بود.
