بخشی از مقاله
چکیده
شانکر باکتریایی از همهی نواحی اصلی کاشت آووکادو از جمله آفریقای جنوبی، چند ناحیه از کالیفرنیا و استرالیا شایع است. از آنجا که کشت آن به تازگی در ایران رواج بسیار یافته بررسی بیماریهای آن اهمیت پیدا میکند. بیماری شانکر باعث ایجاد شانکر روی شاخهها، تنه اصلی و موجب کاهش محصول یا مرگ درختان میشود. در تحقیق حاضر پس از کشت و خالص سازی شناسایی عوامل باکتریایی همراه از آزمونهای فنوتیپی و واکنش زنجیرهای پلیمراز با مارکر مولکولی gyrB استفاده شد نتایج نشان داد که باکتری Raoultella planticola میکروارگانیسم غالب همراه بیماری در مازندران میباشد.
واژگان کلیدی: شانکر باکتریایی، واکنش زنجیرهای پلیمراز، مارکر مولکولی
-1مقدمه
آووکادو - Persea Americana - درختی متعلق به خانواده Lauraceae و از میوههای با ارزش مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری است. نام های رایج دیگر آن گلابی تمساح، آووکاتو و آهوکات است. میوه آووکادو بهعلّت داشتن چربی بالا یک منبع ارزشمند انرژی و از لحاظ تغذیهای بسیار حائز اهمیت می باشد - . - 1 درختانی که آلودگی شدید دارند تأخیر در رشد، برگ ریزی و کاهش محصول را نشان میدهند - . - 5 شانکرها ابتدا در قاعدهی درخت و سپس به سمت بالا و کمتر به سمت پایین و اطراف گسترش مییابند. نواحی آلوده کمی فرو رفته و رنگ آنها نسبت به پوست سالم اطراف تیرهتر است. بافتها قرمز-قهوه ای و مایعی روان که از پوست به پایین جریان مییابد از نشانهها همراه با شانکر است. رگههایی باریک و قهوهای به داخل بافتهای بالا و پایین شانکر گسترش مییابد. در بهار و پاییز ترشحات سفید اطراف زخمها را میپوشاند . - 6 -
چند گونه از خانوادهی Enterobacteriaceae و Xanthomonasaceae نیز به عنوان میکروارگانیسمهای همراه شانکر تا کنون شناسایی شدهاند 5 - و. - 6 -2مواد و روش ها ساقه آلوده زیر شیر آب شسته و قطعات حاوی علائم درون ظرف پتری استریل قرار داده و پس از سه بار شستشو با آب استریل سپس همراه با مقداری آب به قطعات کوچک خرد شدند، پس از 30 دقیقه نگهداری در دمای اتاق با یک لوپ از سوسپانسیون روی محیط کشت NAS - نوترینت آگار -سوکروز - کشیده شد. تشتکهای پتری کشت شده در دمای 25 درجه سلسیوس نگهداری شدند. کلنیهای باکتری پس از 3 تا 4 روز ظاهر شدند. سپس از کلونیهای رشد کرده تک کلونیها برداشته شده و با کشت روی NAS خالص گردیدند.
استخراج DNA به روش لایز قلیایی انجام شد. یک لوپ از هر جدایه ی باکتری از روی NAS به لولههای اپندورف حاوی 1000 میکرولیتر آب مقطر استریل منتقل گردید. لولهها روی شیکر لوله تکان داده شد و سوسپانسیون باکتری به دست آمد. سپس مقدار 0/1 حجم از محلول KOH ده درصد به سوسپانسیونها اضافه گردیده و لولهها در آب جوشان بهمدّت 2 تا 5 دقیقه قرار گرفت. لولهها در12000 دور در دقیقه بهمدّت 5 دقیقه سانتریفیوژ شدند. سپس مایع رویی به لولههای جدید منتقل و غلظت تقریبی DNA با استفاده از الکتروفورز در ژل آگارز مشخص شد - شکل . - 2 از این محلول حاوی DNA به عنوان قالب در - 4 - PCR استفاده شد. آزمون PCR برای تکثیر قطعهای از gyrB - جدول - 1 با بهکارگیری آغازگرهای این ژن و تکثیر شده با الکتروفورز در ژل آگارز - 2 - انجام شد. قطعه تکثیر یافتهی جدایهها جهت توالییابی به شرکت بایونیر - کره جنوبی - ارسال شد. توالیهای قطعه gyrB حاصله در پایگاه NCBI و با استفاده از ابزار BLAST با توالیهای ذخیره شده در پایگاه دادهها مقایسه شده و تشابه آنها با باکتریهای موجود تعیین شد.
-3نتایج و بحث
به منظور جداسازی باکتری از درختان آووکادو آلوده به شانکر در مازندران نمونه برداری شد و روی محیط جامد آگار غذایی کشت شد. پس از 48 ساعت پرگنههای رشد یافته در سطح محیط کشت خالصسازی و برخی از ویژگیهای مورفولوژیک و بیوشیمیایی پرگنههای غالب، با استفاده از روشهای متداول باکتریشناسی تعیین شد.در تمامی نمونههای بهدست آمده جمعیتی نسبتاً بالا از یک باکتری گرم منفی، که روی محیط کشت EMB تولید هاله سبز متالیک مینمود، مشاهده شد. کلونی مایل به رنگ کرم، گرد، محدب و با حاشیه صاف روی محیط NAS است - شکل . - 1 برای شناسایی نهایی مورد آزمون مولکولی واکنش زنجیرهای پلیمراز قرار گرفت. نتایج نشان داد که توالی نوکلئوتیدی جدایه آووکادو، 99 درصد مشابه با توالی ناحیه gyrB در باکتری Raoultella planticola است و بر اساس دندروگرام ترسیم شده، با این گونه در یک گروه قرار میگیرد و یکی از عوامل همراه شانکر درختان آووکادو شمال ایران است. همچنین نتایج بیانگر تفاوت در آسیبشناسی - Etiology - شانکر آووکادو مشاهده شده در مازندران با مناطق دیگر دنیا است.
پیشنهادها
پیشنهاد میشود بررسی در سطح وسیعتری از ایران صورت گیرد. از مارکرهای مولکولی بیشتری جهت شناسایی استفاده شود. برای بررسی تنوع مولکولی پاتوژن با انجام آزمون .RepPCR بررسی دامنه میزبانی بیمارگر. بررسی روشهای پیشگیری و کنترل عامل شانکر.
