بخشی از مقاله
چکیده
گلابی بهعنوان یکی از اعضاي خانوادهي گلسرخیان از جمله گیاهان خودناسازگار با ناسازگاري گامتوفیتیک محسوب می شود. نوع و میزان ناسازگاري در این سیستم بهواسطهي یک خانوادهي ژنی چند آللی در مکان ژنی S کنترل میشود. تنوع موجود در ژن خودناسازگاري، شناسایی و تفکیک کامل آللها را مشکل تا غیرممکن میکند. بدین منظور با هدف شناسایی دقیق نوع آلل خودناسازگاري در ارقام گلابی و همچنین ارزیابی توانمندي مارکر پی.سی.آر- آر.اف.ال.پی بهعنوان یک روش مرجع ساده، منسجم و جامع در شناسایی این دسته از ژنها، روشهاي مقدماتی سابق، در قالب یک روش کلی مشتمل بر گروهبندي آللها، طراحی آغازگر و انتخاب آنزیمهاي برشی سازماندهی شد.
بهمنظور دستیابی به نواحی حفاظت شدهي ژن خودناسازگاري، پس از دریافت تمامی -S آللهاي بهودیعه گذاشته شده در بانک NCBI، تشابه آللها در نرمافزارهاي Word و ClustalW2 بررسی شده و آللهاي مشابه همگروه شدند. طراحی آغازگرها و ارزیابی نواحی برش آنزیمهاي محدودگر، با استفاده از نرمافزار OLIGO صورت گرفت. گروهبندي صحیح آللهاي خودناسازگاري، منجر به دستیابی به نواحی حفاظت شدهي ژن و طراحی یک جفتآغازگر بهنام FB-F/FB-R2 با حداکثر قابلیت تکثیر آللها شده و استفاده از الگوي باندي خاص حاصل از 4 آنزیم برشی DraI، EcoRI، MspI و HaeIII، تفکیک کامل آنها را میسر کرد. پیگیري شیوهي مطالعاتی اجرا شده در این تحقیق سهولت، دقت و جامعیت مارکر مذکور را در ردیابی و شناسایی آللها به اثبات رساند.
مقدمه
سیستم خودناسازگاري در گیاه گلابی از نوع گامتوفیتیک است که توسط مکان ژنی S با چندین آلل کنترل میشود . - 2 - استفاده ازگردهافشانی کنترل شده و بررسی میزان تشکیل میوه - 4 - ، روشهاي بیوشیمیایی - 7 - و یا مبتنی بر پی.سی.آر - 5 - از جمله روشهاي ارزیابی وضعیت ناسازگاري ارقام درختان میوه و از جمله گلابی محسوب میشوند. شناسایی آللهاي S بر مبناي پی . سی.آر ضمن داشتن سرعت و ضریب اطمینان بالاتر، قابل استفاده در برنامه هاي اصلاحی و حتی مشخص کردن شجره نامه و منشأ آللهاي ژن و ژنوتیپهاي حامل آنهاست 1 - ، . - 6 موتا و همکارانش - 2007 - به دلیل ارزیابی ناقص آللهاي خودناسازگاري، با طراحی 5 جفت آغازگر تنها توانستند 11 آلل را در 14 رقم گلابی اروپایی شناسایی کنند.
همچنین 9 آلل در 9 رقم آسیایی، با استفاده از سه جفت آغازگر و 9 آنزیم برشی شناسایی شدند . - 3 - کوشش صبا - 1383 - براي اولین بار در ایران، با بهکارگیري سه جفت آغازگر از پیش طراحی شده اقدام به استفاده از روشهاي مولکولی جهت شناسایی آللهاي خودناسازگاري در 11 رقم گلابی نمود که توانست تنها یک آلل را به طور قطع و دو آلل را بصورت مشکوك شناسایی کند. بر اساس مطالعات انجام شده، در صورت ارزیابی جامع آللها در طول و ماهیت توالی و همچنین طراحی صحیح آغازگر در مناطق مناسبی از نواحی حفاظت شدهي ژن خودناسازگاري، تکثیر و به دنبال آن شناسایی دقیق اکثریت تا تمامی آللهاي ژن امکانپذیر است . - 1 - این تحقیق با هدف طراحی یک سیستم جامع، ساده و کارآ براي شناسایی آللهاي خودناسازگاري ارقام گلابی و اعضاي سایر خانوادههاي ژنی انجام گرفته است.
مواد و روشها
کلیهي آللهاي S شناسایی و بهودیعه گذاشته شده متعلق به گونههاي مختلف جنس گلابی در بانک اطلاعاتی NCBI جستجو ومجموعاً بیش از200 آلل دریافت شد. سپس آللهاي مربوط به توالی c-DNA و آللهاي تکراري با به کارگیري نرمافزار ClustalW2 و ابزار find and replace نرمافزار Word حذف و آللهاي همنام نامشابه نیز بهعنوان دو آلل مجزا در لیست آللها قرار گرفتهو نهایتاً تعداد63 آلل با ذکر گونهي حامل آن، گردآوري شد - جدول. - 1 مجموعهي آلل هاي گردآوري شده در نرمافزار ClustalW2 همردیف شده و با اثبات عدم کارآیی نرمافزار در همردیفسازي تعداد بالاي دادههاي ورودي، گروههاي آللی در دو مجموعهي کوچکتر به ترتیب گروه آللهاي همگونه و دیگري گروه آللهاي با طول هاي مشابه همردیف شدند.
پس از آخرین گروهبندي، با آشکار شدن نواحی حفاظت شدهي ژن، طراحی آغازگرها با استفاده از نرمافزار OLIGO در آن مناطق انجام گرفته و طول باندهاي حاصل از تکثیر تمامی آللها تخمین زده شد - شکل - 1 - جدول. - 1 باندهاي همطولحاصل مجدداًاز لحاظ تاثیر آنزیمهاي محدودگر، در OLIGO مورد ارزیابی قرار گرفته و آنزیم هاي متداول با حداکثر قابلیت تفکیک در ژن خودناسازگاري، به منظور شناسایی دقیق نوع آلل، گزینش شدند.
نتایج و بحث:
از میان تمامی آللهاي Sگردآوري شده جمعاً26 آلل متعلق به گونهي Pyrus. communis، 17 آلل متعلق به گونهيP. pyrifolia و مابقی متعلق به گونهي P. ussuriensis و گونههایی با اهمیت تجارتی کمتر، نظیر P. Syriaca و P. korshinskyi، بودند - جدول. - 1 بررسیها نشان داد که نرمافزار ClustalW2 در مواجهه با دادههاي زیاد با طولهاي غیر مشابه، در ارائهي نوکلئوتیدهاي همنظیر فاقد کارآیی بوده و بنابراین قابلیت آشکارسازي نقاط همردیف در مجموعهي کامل آللهاي خودناسازگاري را ندارد. به همین ترتیب، مشخص شد که با وجود تفاوت در ماهیت آللهاي خودناسازگاري گونه هاي مختلف که با ریشهي ژنتیکی آنها مرتبط است - 1 - ، از نظر طول، هیچ شباهت درونگونهاي بین آللها وجود ندارد.
