بخشی از مقاله
چکیده:
روش - Random amplified polymorphic DNA - RAPD یکی از پرکاربردترین شیوه های انگشت نگاری DNA است. چون عوامل زیادی می توانند الگوی باندی RAPD را تغییر دهند، این روش نسبت به تغییرات شرایط PCR حساس است. تفسیر تغییرات در الگوی باندی RAPD مشکل می باشد،. اما، شناسایی آن فاکتورها اهمیت زیادی دارد. چون تجزیه و تحلیل های بعدی باندهای بوجود آمده در الگوی RAPD به ما اجازه می دهد تا برخی وقایع مولکولی که در ناپایداری ژنوم نقش داشته را شناسایی کنیم. هم چنین، ژن هایی که نقش های کلیدی داشته را کشف نماییم.
برای بهبود بیشتر کاربرد آزمایشات RAPD، شناسایی فاکتورهای موثر روی تغییرات RAPD و بهینه سازی شرایط واکنش RAPD-PCR ضروری می باشد. در یک سری آزمایش های مقدماتی غلظت های مختلف ترکیبات مخلوط واکنش PCR روی تکرارپذیری الگوهای باندی RAPD و بازده محصول PCR بررسی شد. نتایج نشان داد، زمانی که غلظت ترکیبات مخلوط واکنش PCR پایین بود، حتی در دماهای اتصال پایین هیچ محصولی تولید نشد. افزایش غلظت ترکیبات مخلوط واکنش در موفقیت PCR، افزایش بازده محصولات PCR و تکرارپذیری الگوهای باندی RAPD تاثیر زیادی داشت.
نتایج بعدی نشان داد که دمای اتصال و حجم مخلوط واکنش PCR به اندازه غلظت ترکیبات مخلوط واکنش اثر چشمگیری در موفقیت PCR ،افزایش بازده محصولات PCR و تکرارپذیری الگوهای باندی RAPD داشت. در حجم واکنش 35 میکرولیتر شامل : 3/5 ʽ l از بافر 10X PCR، 8 mM یون منیزیم، 4 ʽM پرایمر، mM dNTP 0/44، DNA 120ng الگو و 3 واحد Taq پلیمراز در دمای اتصال 36 درجه سانتی گراد محصولی تولید نشد، اما در دمای اتصال 34 درجه سانتی گراد تعداد کمی محصول تولید شد.
در دمای اتصال32 درجه سانتی گراد برای اکثر نمونه ها محصول PCR تولید شد. نهایتا در حجم واکنش 50ʽl شامل: 5ʽ l از بافر DNA 120ng , 10X PCR الگو، 8mM یون منیزیم، 4ʽM پرایمر، dNTP 0/44mM و 3 واحد Taq پلیمراز در دمای اتصال 32 درجه سانتی گراد بازده واکنش PCR افزایش یافت. هم چنین، الگوهای باندی RAPD برای بخش های مختلف گیاهچه های سیب زمینی کشت شده در کشت بافت یکسان بود. بنابراین، با بهینه سازی شرایط واکنش آزمایشات RAPD تکرارپذیر و معتبر می باشند.
