بخشی از مقاله
چکیده
موتاسیونهاي شناخته شدهاي که اثر عمدهاي بر بازدهی تولیدمثلی گوسفند - و بز - ردارند در ژنهايرخانواده بزرگ TGF-βر یعنی ر رBMP15 ریا GDF9B، ر رGDF9 رو BMPR-IB ریا ALK6 رشناسایی شدهاند. ردر ژن رGDF9، رموتاسیون رFecGHر مهمترین موتاسیونرشناخته شده است که بررسیهاي ابتدایی وجود آن را در بزهاي مرخوز و رایینی تایید نکرده است.ر جستجو براي موتاسیون جدید در گونه بز به روش مستقیم تعیین توالیراگزون دوم ژن GDF9، موجب شناسایی یکرتغییر نوکلیوتیدي عموتاسیونلاردر جایگاه شماره 959رشد که با بازانجامی تعیین توالیرو هضم آنزیمی تایید شد.راین موتاسیون، منجر به جایگزینی یک آمینواسید قطبی عگلوتامینلاربا یک آمینواسید غیرقطبی عپرولینلارمیشود.ربه نظر می رسد که این موتاسیون ساختار و کنش هاي پروتین GDF9ررا تغییر دهد و با نرخ چندقلوزایی در بزهاي رایینی و مرخوز در ارتباط باشد.ربراي روشن کردن اثر این موتاسیون بر فنوتیپ بز مرخوز و رایینی بررسیهاي بیشتري نیاز است.
واژه هاي کلیدي، موتاسیون، GDF9، بز رایینی، بز مرخوز
مقدمه
موتاسیونهایی که اثر عمدهاي بر نرخ تخمکریزي دارند روي هم رفته، در ژنهاي BMP15، BMPR-1Bرو GDF9ردیده شدهاند . - Davis 2004 - رمیزان اثر یک کپی از موتاسیون بر افزایش نرخ تخمکریزي در هر چرخه فحلی از 0/4ربراي ژن Woodlandsرع;FecX2ردر ژن BMP15لارتا 1/5ربرايرموتاسیون FecBردررژن BMPR-1Bرمتغیر است . - Davis, 2004 - ربیشتر این موتاسیونها در گوسفند شناسایی شدهاند و روي هم رفته پژوهشهاي اندکی روي بز و نقش ژنهاي موثر بر چندقلورایی در آنها انجام شده است.ردر پژوهش Silvaرو همکاران ع2005لا، اهمیت BMP15رو GDF9ردر نمو فولیکولی تخمدان بز، با بررسی بیان ژنهاي آن ها مشخص. رولی تاکنون پژوهشهاي بسیار اندکی درباره ژنهاي اصلی موثر بر باروري و نرخ تخمکریزي در این گونه انجام شدهاند.
آزمایشهاي DNAرراهی براي بهکارگیري این ژنها در صنعت دامپروري و یک ابزار کارآمد براي تعیین اساس ژنتیکی باروري بالا در نژادهاي گوسفند و بز در دنیاست . - Davis, 2004 - ر فزون بر موتاسیون BMP15، نژادهاي Cambridgeرو Belclareرداراي یک موتاسیون دررژن GDF9ر - - FecGH رهستند که در میشهاي هتروزایگوت نرخ تخمکریزي را افزایش میدهد و در میشهاي هوموزایگوت موجب ناباروري میشود.راثر موتاسیون GDF9ربیشتر از اثر موتاسیون BMP15راست به گونهاي که یک کپی از FecGH رردر نژادهاي Cambridgeرو Belclareرنرخ تخمکریزي را به میزان 1/4رتخمکریزي در هر چرخه فحلی افزایش میدهدرعHanrahan et al., 2004لا.رر ژن GDF9رداراي دو اگزون و یک اینترون است و در گوسفند روي کروموزوم 5رقرار گرفته است.
اندازه آن bpر2500ر است و یک پیش-پیش پروتین داراي 435رریشه آمینواسیدي را رمزدهیرمیکند که پس از ویرایش، پپتید فعال آن داراي 135رآمینواسید است. رشماره دستیابی این ژن در Genbankربرابر با EF446168راست.ردر موتاسیون شناخته شده GDF9ر عFecGHلا، یک ریشه سرین قطبی بدون بار عریشه 77رGDF9ربالغلاربه یک فنیلآلانین غیرقطبی در ناحیهاي از ملکول تغییر مییابد که احتمال میرود در پیوندیافتن با گیرنده تایپ Iرنقش داشته باشد عKirsch et al ., 2000لا.ربنابراین، این موتاسیون میتواند بر توانایی لیگاند در پیوند یافتن به گیرنده اثر بگذارد.ردر GDF9رکه باندهاي هیدروژنی بین مونومرها براي حفظ پایداري دایمر ضروري هستند، احتمال دارد که موتاسیون FecGH ربا به همزدن دایمریزاسیون بر فعالیت بیولوژیکی این پروتین اثر بگذارد عHanrahan et al., 2004لا.
مواد و روشها
نمونههاي DNAراز 110ربز نژاد رائینی که از ایستگاه اصلاح نژاد بز کرکی عرایینیلاردر شهرستان بافت استان کرمان و نیز 80ربز نژاد مرخوز از ایستگاه تحقیقاتی بز مرخوز در سنندج که به گونهاي تصادفی گرفته شده بودند، تهیه شدند.رگامهرهاي استخراج DNAراز نمونهرهاي خون عموجود در لولهرهاي 10رمیلی لیتري داراي ماده ضد لخته EDTAربا غلظت mg/mlر 1/5لا ربا استفاده از کیت ر ر عHigh Yield DNA Purification Kitلا، بر اساس دستور کار شرکت سازنده، انجام شد.ربراي تکثیر ناحیه اگزون 2 رژن GDF9، واکنش زنجیرهاي پلیمراز در حجم 25 رمیکرولیتر و با استفاده از آغازگرهاي 5'-نانوگرم DNAرژنومی، 1/5رتا 2/5رمیلی مولاررمنیزیم و نیز Taq DNA Polymeraseردر 35رسیکل و دماي Annealingر برابر با 58ردرجه سانتیگرادرو 55 رثانیهرانجام شد .
ربخش تکثیر شده در PCR، پس از تشخیص روي ژل آگاروز 1ردرصد، به درون ناقل pTZ57R/Tرمنتقل شد.ربراي این کار، 4رمایکرولیتر ع0/165رمایکروگرملارپلاسمید ناقل، 3رمایکرولیتر بافر Ligationرعغلظت 10ربرابرلا، 3رمایکرولیتر محلول PEG 4000رع50 W/Vشلا، یک مایکرولیتر ع5UلارازT4 DNA Ligaseربه 16رمایکرولیتر آب دي یونیزه افزوده شد و پس از مخلوط شدن براي یک شب در 22ردرجه سانتیگراد نگهداري شد و از آن براي همسانهسازي استفاده شد. رپس از انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتري DH5αرگامههاي گزینشررکلونیها و پس از آن استخراج پلاسمید با استفاده از High Pure Plasmid Isolation Kit - Roche - رو طبق دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد.رپلاسمیدهاي استخراج شده براي تعیین توالی به همراه آغازگرهاي آن به شرکت Macrogenرکره جنوبی ارسال شدند.ر توالیهاي به دست آمده با توالیهاي GDF9 ردر بز و گوسفند که در GenBank رارایه شدهاند مقایسه شدند. رهمردیفی توالیها با استفاده از نرم افزار Clustal Wرانجام و آزمون RFLPرو تایید موتاسیونهاي دیده شده در تعیینرتوالی، با آنزیم BcnIربا 15رمایکرولیتر محصول PCRرو حجم پایانی 30رمیکرولیتر انجام شد.
نتایجنتایج حاصل از تعیین توالی اگزون 2رژن GDF9ردر بزهاي نژاد رایینی و مرخوز به همراه آزمون RFLPرنمونه ها با آنزیم BcnI رنشان دادند که موتاسیونی در ژن GDF9 ردر بزهاي این دو نژاد وجود داردرکه تاکنون گزارش نشده است.راین موتاسیون، یکر رNon-conservative Substitution راز نوع Transversion A/C ردر نوکلیوتید 959 رناحیه رمزگردان ژن
GDF9، است که موجب تبدیل کدون آمینو اسید قطبی گلوتامین عGln;CAGلا ربه آمینو اسید غیر قطبی پرولینعPro;CCGلاردر دومین ریشه آمینواسیدي پروتئین بالغ عMature Peptideلارشده است.
