بخشی از مقاله
چکیده
نگرانی های موجود براثر کاهش ذخایر سفره های آب زیرزمینی باعث نگرانی هایی شده است از سوی دیگر خطر فشار بیش از حد بر مخازن فاضلاب و هزینه سنگین آن سبب تهدید انواع گیاهانی شده است که در چرخه غذایی انسان ها جای دارند و این به معنی بازگشت دوباره این مواد آلاینده به بدن انسان است. تشدید نگرانی ها در این زمینه سبب گسترش فعالیت ها در زمینه بازیافت فاضلاب شده است.
در این تحقیق سعی شده که علاوه بر حذف مواد خطرناک فاضلابها، از مواد شیمیایی و آلی محلول در فاضلاب به عنوان محیط کشت مناسبی برای رشد میکروارگانیسم ها استفاده شود. میکروارگانیسم شناسایی شده در این تحقیق، میله ای شکل، برون سلولی و متعلق به خانواده آلکالیژن1 بود. همچنین بیماری زا نبوده و قادر به تولید گروهی از مواد شیمیایی به نام سورفکتانها بودند. باکتری جداسازی شده توانایی امولسیون کنندگی - E24 - ، 75 درصد در شرایط بهینه را دارد.
-1مقدمه
میکروارگانسیم ها برای نمو به کربن به عنوان منبع آلی، نیتروژن، فسفات، سولفات، آهن، منیزیم، پتاسیم و کلسیم به مقدار زیاد نیاز دارند و به میزان کمتر به مولیبدن، روی، منگنز، سدیم، کلرید، سلنیم، کبالت، مس، نیکل و تنگستن نیاز دارند. همچنین سلول های هوازی برای تولید انرژی به پذیرنده و الکترونی از قبیل اکسیژن، نیتررژن یا سولفات نیاز دارند و سلول های بی هوازی، به ترکیباتی مانند گلوکز، ساکارز و یا لاکتوز نیازمندند. همچنین برخی از میکروبها به یک منبع نیتروژن آلی از قبیل پروتئین و یا مقدار کمی ویتامین نیاز دارند.
مواد آلی مهم در فاضلاب عبارتند از:
- پروتئین ها که از اجزای سازنده سلولهای زنده می باشند، مولکولهای پلیمری هستند که اجزای سازنده خود آنها اسید های آمینه می باشد. به طور کلی 20 نوع اسید آمینه وجود دارد که انواع پروتئین های مختلف را می سازند.
- کربوهیدراتها شامل قندها، مواد نشاسته ای و مواد سلولزی می باشند.
- گریس که شامل چربیها و روغنها می باشند. این مواد از واکنش اسیدهای چرب با الکل یا گلیسرول بوجود می آیند. و چنانچه این ترکیبات در دمای معمولی مایع باشند آنها را روغن و ترکیبات جامد را چربی می نامند. محتوای گریس یک فاضلاب را توسط هگزان می توان استخراج نمود.
- سورفاکتانتها یا مواد فعال سطحی در مواد شوینده وجود دارند و وارد فاضلاب می شوند. وجود این مواد در فاضلاب باعث تولید کف پایدار در فاضلاب می گردد. دو دسته مهم از سورفاکتانتها عبارتند از آلکیل بنزن سولفوناتها - - ABS که غیر قابل تجزیه و مشکل ساز هستندو آلکیل سولفوناتهای خطی - LAS - که تخریب پذیر زیستی هستند. سورفاکتانتها را با اندازه گیری تغییر رنگ در محلول استاندارد متیلن بلو اندازه گیری می کنند.
- فنلها، ترکیباتی هستند که به خاطر فعالیتهای صنعتی وارد فاضلاب می شوند. این ترکیبات دارای سمیت بالا بوده و وجود آن در آب آشامیدنی باعث طعم نامطبوع آن می شود. فنل را می توان با واکنشهای رنگ سنجی و همچنین کروماتوگرافی گازی تعیین کرد. فنل تا غلظت 500mg/lit را می توان با روشهای بیولوژیک تصفیه نمود.
- آفت کشها و دیگر مواد شیمیایی کشاورزی که وجود میزان جزئی آنها در فاضلاب برای موجودات زنده زیان آور می باشد. غلظتهای بالای این مواد باعث مرگ ماهی ها و آبزیان شده و مقادیر کم آن با ورود به بافتهای موجودات آبزی باعث کاهش ارزش غذایی آنها می شود. بنابراین تعیین غلظت دقیق این ترکیبات حائز اهمیت است و این کار را می توان با دستگاه کرواتو گراف گازی انجام داد
روشهای رایج برای ارزیابی محتوای آلی فاضلاب عبارتند از:
- تعیین میزان اکسیژن مورد نیاز برای اکسیداسیون بیولوژیک مواد آلی - BOD -
- تعیین میزان اکسیژن مورد نیاز برای اکسیداسیون شیمیایی مواد آلی - COD -
- اندازه گیری کربن آلی کل - - TOC
- اندازه گیری اکسیژن کل مورد نیاز
برای اینکه میکروارگانیسمها بتوانند مواد آلی موجود در فاضلاب را اکسید کنند، اکسیژن لازم است و BOD معرف میزان اکسیژن مورد نیاز برای این کار است. معمولاً زمان واکنش 5 روز در نظر گرفته می شود و این فاکتور به صورت BOD5 بیان می شود. نحوه اندازه گیری BOD5 به صورت زیر می باشد: ابتدا نمونه فاضلاب مورد نظر تا حد معینی رقیق می شود .[4-7] سپس غلظت اکسیژن حل شده پیش از افزودن کشت میکروبی مشخص می گردد. نمونه به مدت 5 روز در گرمخانه با دمای ثابت قرار داده می شود. و در نهایت غلظت اکسیژن در نمونه در انتهای گرماگذاری اندازه گیری می شود
BOD5 از اختلاف غلظت اکسیژن در ابتدا و انتهای عملیات و با در نظر گرفتن میزان رقیق سازی اولیه فاضلاب قابل محاسبه است. واکنش بیولوژیک فوق معمولاً در دمای 20 درجه سلسیوس انجام می شود. تحت شرایط فوق زمان مورد نیاز برای کامل شدن واکنش حدود 20 روز است و در مدت 5 روز اول 60 تا 70 درصد از مواد آلی اکسید می شوند. با داشتن سینتیک واکنش BOD می توان میزان BOD در زمانهایی غیر از زمان اندازه گیری شده را تخمین زد
-2 مواد و روشها
-1-2 مواد شیمیایی
مواد مورد استفاده در این تحقیق به قرار زیر است.
NaNo3, K2HPO4, KCl, MgSO4, 7 H2O, Agar, NaCl, CaCl2, FeSO4. NH4Cl.7H2O, Glycerol, Na2HPO4, - NH4 - 6Mo7O24 و گازوئیل موجود در فاضلاب به عنوان منبع کربن.
-2-2 وسایل مورد نیاز
ارلن ؛ لوله های آزمایش؛ پلیت؛ شیکر؛ اتو کلاو؛ انکوباتور؛ هود؛ تنسیومتر؛ اسپکتو فتومتر؛ سیستم پایلوت .
-3-2روش کشت میکروبی
میکروارگانیسم ها با روش های مرسوم میکروبیولوژی تهیه و با انجام آزمایش های متداول امولسیون کنندگی - E24 - ، همولیز بلاد آگار، فروپاشی قطره ای جداسازی می شوند. مواد محیط کشت به شرح جدول 1 از شرکت مرک با خلوص آزمایشگاهی تهیه شد.
درون ارلن ها از محیط کشت ریخته می شود. در این محیط های کشت ابتدا از گلوکز به عنوان منبع کربن استفاده می شود. سپس همه ارلن ها درون اتو کلاو در دمای 110 سانتیگراد استریل می گردند. در ادامه درون ارلن ها به اندازه %2 نفت خام جهت جداسازی میکروارگانیسم ریخته شده و آنها را درون شیکر با دمای 30 درجه سانتیگراد و سرعت 160rpm به مدت 4 روز قرار داده شده، سپس هر کدام از ارلن ها به صورت خطی بر روی محیط نوترینت آگار، درون پلیت کشت و پلیت ها درون انکوباتور در دمای 30 درجه سانتیگراد انکوبه می شوند. با رشد میکروب ها درون پلیت، کلنی های خالص بوسیله لوپ جدا شده و بر روی نوترینت آگار و در نوترینت براث کشت داده می شوند. بعد از رشد و تقویت کلنی های خالص در محیط نوترینت براث، دوباره آنها درون ارلن های حاوی محیط کشت استریل تلقیح شده و درون شیکر قرار داده می شوند.
جدول :1 محیط کشت انتخابی برای جداسازی میکروارگانیسم ها وکشت غوطه ور
-4-2آزمایش امولسیون کنندگی - E24 -
برای جداسازی باکتریهای تولید کننده بیوسورفکتانت آزمایش امولسیون کنندگی - - E24 ، آزمایشی سریع و مناسب است. در این آزمایش ابتدا درون لوله آزمایش 4 ml نفت خام ریخته و درون اتوکلاو استریل می شود. سپس بر روی نفت استریل شده درون لوله آزمایش 2ml از محیط کشت حاوی میکروب خالص را ریخته، و به مدت 2 دقیقه با ورتکس مخلوط کرده، سپس لوله آزمایش به مدت 24 ساعت به حالت سکون قرار داده می شود. بعد از 24 ساعت حجم قسمت امولسیون را به حجم کل داخل لوله تقسیم کرده تا مقدار امولسیون ایجاد شده توسط میکروب به دست آید.
-5-2 رشد میکرو ارگانیسم در شرایط بهینه
در بخشهای قبل میکرو ارگانیسم تولید کننده بیوسورفکتانت تولید و جداسازی شد. در این بخش از مطالعه، به بررسی رشد میکروارگانیسم در شرایط بهینه پرداخته شده است.
مقداری از میکروارگانیسم اصلی موجود بر روی اسلنت به محیط نوترینت انتقال داده می شود و به مدت 24 ساعت برای در اختیار داشتن تعداد میکروارگانیسم کافی در یک شیکر انکوباتور با سرعت 160rpm و دمای 40 درجه سانتیگراد قرار داده می شود. بعد از تقویت میکروارگانیسم در محیط نوترینت به میزان 10ml از این محیط جدا شده و باکتری های موجود در آن با کمک سانتریفوژ با سرعت 3000 rpm و به مدت 15 دقیقه جدا می شود و به یک ارلن مایر 1 لیتری حاوی 500 ml محیط کشت M2 انتقال داده می شود. جهت رسم منحنی رشد میکرو ارگانیسم، محیط کشت به شرح جدول 2 تهیه می شود.
جدول :2 محیط کشت شرایط بهینه در آزمایش های امولسیون کنندگی و فروپاشی ذره
این محیط کشت به یک شیکرانکوباتور با سرعت 160rpm، دمای 50 درجه سانتیگراد، غلظت نمک 7/5 درصد و PH حدود 7 منتقل و هر دو ساعت یک بار مورد بررسی قرار گرفت. برای اندازه گیری میزان توده زیستی از سنجش میزان میکروارگانیسم ها در 660 نانومتر استفاده شد. نمونه گیری و جداسازی میکروارگانیسم تولید کننده بیوسورفکتانت نفت خام مورد استفاده قرار گرفت. میکروب مورد استفاده توسط آزمایش های متداول امولسیون کنندگی - E24 - ، همولیز بلاد آگار، فروپاشی قطره ای از نمونه نفتی تهیه شده و جداسازی گردید. مواد شیمیایی بکار رفته در محیط کشت مطابق جدول 1 تهیه گردید.
نتایج حاصل از انجام آزمایش های امولسیون کنندگی - E24 - ، خلاصه شده و با مقایسه نتایج مذکور سویه اصلی انتخاب شده است. -با توجه به آزمایش های بیوشیمیایی و میکروبیولوژی متداول، میکروارگانیسم شناسایی شده، میله ای شکل، برون سلولی و از خانواده Alcaligenes sp. می باشد .
در ازمایش E24 سویه های جداشده از نفت خام به مدت هفت روز در محیط کشت مطابق با جدول 1 با منبع کربن گلوکز کشت داده شدند و بعد از این مدت نتایج ثبت گردید.
بعد از انجام آزمایش های امولسیون کنندگی - - E24، فروپاشی قطره، همولیز بلاد آگار و پلیت آگار، سویه های K5 و K4 انتخاب و سپس این سویه ها بر روی محیط کشت با منبع کربن گلوکز کشت داده شدند و به مدت 7 روز بر روی این سویه ها آزمون امولسیون کنندگی - E24 - انجام گرفت.
با توجه به نتایج بدست آمده از آزمایش امولسیون کنندگی - E24 - بر روی 2 سویه ی فوق، سویه K5 به عنوان سویه اصلی جهت ادامه کار انتخاب شد. سپس آزمایش امولسیون کنندگی با نسبت های مختلف بر روی سویه اصلی آزمایش شد که نتایج آن در جدول 3 آمده است.
جدول :3 نتایج مربوط به آزمایش امولسیون کنندگی بر روی سویه K5 با نسبت های مختلف محیط کشت
-3 رشد میکروارگانیسم
-1-3 منحنی رشد میکروارگانیسم،
جهت رسم منحنی رشد میکروارگانیسم، محیط کشت به شرح جدول 2 تهیه شد.
این محیط کشت به یک شیکرانکوباتور با سرعت 160rpm ، دمای 50 درجه سانتیگراد، غلظت نمک 7/5 درصد و PH حدود 7 منتقل و هر دو ساعت یک بار رشد میکروارگانیسم مورد بررسی قرار گرفت. برای اندازه گیری میزان توده زیستی از سنجش میزان میکروارگانیسم ها در 660 نانومتر استفاده شد. نتایج در شکل 1 آورده شده است.
شکل:1 نتایج مربوط به منحنی رشد میکروارگانیسم در شرایط بهینه
-2-3 اثر pH
اغلب میکروب ها در دامنه pH بین 5 تا 9 می توانند فعالیت کنند. همان طور که در شکل - 2 - مشاهده می شود از 5 pH تا 7، کشش سطحی کاهش می یابد. در طراحی آزمایش ها مشاهده شد که میکروب در pH حدود 5 دارای رشد کمی بوده و در عین حال دارای بیشترین کشش سطحی مشاهده شده می باشد. در pH حدود 7 کمترین کشش سطحی دیده می شود. دلیل این امر این است که میکروب ها در این pH فعالیت خوبی از خود نشان می دهند و محیط برای رشد میکروب مهیا می باشد. ولی در حالت کلی تغییرات pH در بازه 6 تا 8 چندان زیاد نمی باشد برای همین دارای کمترین میزان اثر در بین پارامترهای دیگر است.
شکل :2 نتایج مربوط به درصد بهینه دما، غلظت NaCl ، C/N و pH
در شکل 2 مشاهده می شود که طبق پیش بینی، دما و غلظت NaCl بیشترین اثر را در کاهش کشش سطحی دارند و عامل pH دارای کمترین اثر می باشد. مقدار خطا در طراحی آزمایش ها برابر 16 %می باشد که مقدار نسبتاً قابل قبولی است.
شکل3 نتایج مربوط به آزمایش امولسیون کنندگی، اندازه گیری کشش سطحی و بین سطحی ناشی از عملکرد میکروب در شرایط بهینه می باشد.
