بخشی از مقاله
چکیده
این پژوهش به منظور شناسایی چند شکلی هاي موجود در جایگاه ژنیFecXL در گوسفند نژاد لري-ﲞتیاري اﳒام گرفت. از تعداد 165 راس گوسفند ﳕونه خون ﲥیه و استخراج DNA با استفاده از روش ﳕکی ﲠینه یافته صورت گرفت. کمیت و کیفیت DNA استخراج شده با استفاده از روش اسپکتوفتومﱰي و ژل الکﱰوفورز آنﱰلگردید. با استفاده از یک جفت پراﳝر اختصاصی یک قطعه 312 جفت بازي ازناحیه اگزون دو ژن BMP15 توسط واآنش زﳒﲑه اي پلی مراز - PCR - تکثومتعاقبا تعیﲔ ژنوتیپ ﳕونه ها با استفاده از آنالیزSSCP اﳒام گرفت. بررسی باندهاي حاصل الگوي باندي یکسانی را در ﲤامی ﳕونه ها نشان داد که حاکی از عدم وقوع جهش در جایگاه مذکور در میش هاي ﲢت بررسی می باشد. با توجه به نتایج بدست آمده در این ﲢقیق می توان نتیجه گﲑي ﳕود که جهش نوکلئوتیدي A به G در جایگاه ژنیFecXL در گوسفند نژاد لري- ﲞتیاري رخ نداده است.
کلمات کلیدي : FecXL، نرخ ﲣمک ریزي، پلی مورفیسم، PCR، گوسفند
مقدمه
بازده تولید مثلی1 مهمﱰین عامل مؤثر در سودآوري گله است و صفت تعداد بره متولد شده در هر زایش یکی از مهمﱰین اجزاي این صفت و از ﲨله مهمﱰین عوامل تاثﲑ گذار بر افزیش کارآیی تولید مثل و به تبع آن افزیش کارآیی اقتصادي در صنعت پرورش گوسفند به حساب می آید . از ﲨله عواملی که می تواند این صفت را ﲢت تأثﲑ قرار دهد، افزایش میزان ﲣمک ریزي و دوقلوزایی می باشد. اخﲑا مطالعات ژنتیکی در گوسفند نشان داده آه هر یک از این دو صفت توسط یک دسته از ژن هاي متفاوت با اثرات جزئی و یا توسط فعالیت ژن هاي منفرد با اثرات عمده به نام ژن هاي موثر در باروري آنﱰل می شوند . - 6 -
در دهه هاي اخﲑجهش هایی که میزان ﲣمک ریزي2 را افزایش می دهند در ژهناي BMPR-IB،BMP15 و GDF9 شناسایی شده اند.غلبه ژن BMP15 در گوسفند یک ژن وابسته به جنس با اثرماورائی است که متعلق به خانواده TGF-β می باشد و روي آروموزوم X مکان یابی شده - 3 - ونشان داده شد که براي باروري در حیوانات ماده ضروري است. - 2 - کاهش در میزان بیان ژن BMP15 فعال ﳑکن است منجر به کاهش تعداد تقسیمات میتوز در سلوﳍاي گرانولوزا و در نتیجه کاهش مقدار اینهیبﲔ و اسﱰوئید آزاد شده از هر فولیکول شود. این روند به نوبه خود باعث تأخﲑ در اثرات متوقف کننده روي FSH پلاﲰا شده که در نتیجه، فولیکوﳍاي بیشﱰي براي ﲣمک ریزي آماده می شوند. از طرﰲ، کاهشBMP15 فعال در این حیوانات، منجر به افزایش حساسیت فولیکول به FSH شده که به نوبه خود رشد فولیکول ها شتاب بیشﱰي یافته و ﲣمک ریزي زود رس از فولیکوﳍاي کوچک را به دنبال دارد . - 5 -
آلل FecXL که اخﲑا - سال - 2006 در گوسفندان نژاد لاکان فرانسوي یافت شده است، منجر به تغیﲑ نوکلئوتید G به A در موقعیت 1196 از cDNA ژن BMP15 شده که در نتیجه سبب جایگزیﲏ اسید آمینه سیستئﲔ با تﲑوزین در موقعیت 53 از زﳒﲑه پروتئﲔ بالغ می شود . میش هاي ﳘوزیگوت FecX L/FecXL فنوتیپ ﲣمدانی توسعه نیافته و رگه دار با فولیکوﳍاي متوقف شده در مرحله اولیه رشد فولیکوﱄ و میش هاي هﱰوزیگوت فنوتیپ چند قلوزائی را نشان می دهند 2 - و . - 4هدف از اجراي این پژوهش شناسائی فرم هاي ﳐتلف آللی در جایگاه ژنی FecXL در گوسفند نژاد- لري ﲞتیاري بوده است.
مواد و روش ها
براي اﳒام این آزمایش از تعداد 165 راس گوسفند ایستگاه اصلاح نژاد گوسفند لري- ﲞتیاري، داراي ارزش اصلاحی بالا، پائﲔ و متوسط براي صفات بره زائی به ازاء هر میش ﲢت آمیزش و بره زائی به ازاء هر میش آبسﱳ استفاده شد. برآورد ارزش اصلاحی توسط روش حداآثر درست ﳕائی ﳏدود شده بدون مشتق گﲑي - DFREML - و مدل حیوانی چند صفﱵ با استفاده از روش ﲠﱰین پیش بیﲏ خطی نااریب - BLUP - اﳒام گرفت . با استفاده از لوله هاي حاوی EDTA از گوسفندان مورد نظر خون گیری به عمل آمد و سپس ﳕونه های خون با حفظ زﳒﲑه سرد به آزمایشگاه ژنتیک مولکوﱄ و بیوتکنولوژي دام دانشکده علوم دامی وشیلات دانشگاه مازندران انتقال یافت. استخراج DNA از 3 سی سی خون کامل به آمک روش ﳕکی ﲠینه یافته اﳒام و آمیت و آیفیت DNA با استفاده از ژل آگارز 0/8 درصد تعیﲔ گردید. واآنش زﳒﲑه اي پلیمراز با کمک پراﳝر هاي اختصاصی براي جایگاه ژنی FecXL اﳒام گرفت - جدول. - 1
3SSCP dye ﳐلوط ﳕوده و به مدت 6 دقیقه در دماي 95C ° در دستگاه PCR قرار دادﱘ . سپس ﳕونه ها به سرعت و به مدت 5 دقیقه روي یخ قرار گرفته تا از اتصال ﳎدد رشته هاي مکمل به یکدیگر ﳑانعت به عمل آید. براي تعیﲔ ژنوتیپ، مقدار 8 میکرولیﱰ از این ﳕونه ها به مدت 12 ساعت روي ژل پلی اکریلامید 8 درصد با ولتاژ 150 ولت الکﱰوفورز شدند. براي هر ژل یک ﳕونه از ﳏصول PCR نیز رﳜته شد تا در صورت وجود قطعه غﲑ اختصاصی، موقعیت آن مشخص تا در هنگام تعیﲔ ژنوتیپ دچار مشکل نگردﱘ . براي مشاهده قطعات حاصله از رنگ آمیزي به روش نیﱰات نقره استفاده گردید.
نتایج
در واکنش زﳒﲑه اي پلیمراز براي این جایگاه با استفاده از یک جفت پراﳝر اختصاصی یک قطعه 312 جفت بازي بدون هیچ باند اضاﰲ با موفقیت تکثﲑ شد. نتایج حاصل از آنالیز SSCP نشان داد که الگوهاي باندي بدست آمده براي ﲤام ﳕونه ها ي مورد بررسی یکسان بوده و هیچ گونه جهشی که بتواند الگوي باندي تک رشته اي SSCP را تغیﲑ دهد قابل شناسائی نبود. در نتیجه، ﳘه ژنوتیپ هاي بدست آمده براي این جایگاه در ﳕونه هاي مورد بررسی به صورت مونومرف وحشی - ++ - تعیﲔ شد. نتایج بدست آمده در این ﲢقیق با نتایج حاصل از بررسی ای ن جایگاه در گوسفند نژاد شال ایران یکسان بود . - 1 -
شاید عدم شناسائی این جهش در دو نژاد گوشﱵ از گوسفندان ایران، مؤید این مطلب باشد که جهش FecXL در گوسفندان ایرانی وجود ندارد و جایگاه هاي دیگري رفتار دوقلوزایی در این گوسفندان را کنﱰل می ﳕایند. بودین و ﳘکاران در سال 2006 این آلل را براي اولﲔ بار در یک سویه از گوسفندان گوشﱵ لاکان فرانسه گزارش ﳕودند - 2 - که با نتایج بدست آمده از این آزمایش هیچگونه ﳘخوانی ندارد. با توجه به وجود رکورد فنوت یپی در گوسفندان نژاد ایرانی اما عدم شناسایی چند شکلی آللی در جایگاه هاي ژنی موثر بر دوقلوزایی در گوسفندان نژاد بلوچی، لري- ﲞتیاري، زل و شال، پیشنهاد می شود که در گوسفندان ایرانی جایگاه هاي دیگري غﲑ از جایگاه هاي معمول گزارش شده، مورد آزمون قرار گﲑند.
تشکر و قدردانی
نویسندگان مقاله مراتب قدر دانی و تشکر خود را از مدیریت ﳏﱰم ایستگاه اصلاح نژاد گوسفند لري- ﲞتیاري به جهت در اختیار قراردادن ﳕونه ها و آقاي دکﱰ عباس منفرد در تامﲔ منابع ماﱄ براي اﳒام این ﲢقیق و نیز از ﳘکاري مدیریت ﳏﱰم گروه علوم دامی دانشگاه ﲥران جناب آقاي دکﱰ مرادي شهر بابک در استفاده از امکانات آزمایشگاهی گروه علوم دامی اعلام می دارند.
منابع
-1 زارع ي،. . - 1386 - شناسایی پلی مورفیسم در دو نقطه از ژن مؤثر بر دو قلوزایی - BMP15 - در گوسفند شال. پایان نامه کارشناسی ارشد، دانشکده علوم زراعی و دامی، پردیس کشاورزي و منابع طبیعی کرج. دانشگاه ﲥران.
