بخشی از مقاله
چکیده:
مقدمه: اریتروپوئتین نوترکیب انسانی - rhEPO - بطور وسیع در درمان کم خونی استفاده میشود. اما به دلیل نیمه عمر کم، مصرف آن به عنوان دارو محدود شده است زیرا براي رسیدن به اثرات درمانی باید هفتهاي 2-3 بار آن را تزریق نمود. ثابت شده است پگیلاسیون باعث افزایش نیمه عمر پلاسمایی پروتئینها میشود. از اینرو به عنوان یک روش بهبود خواص فارماکوکینتیکی پروتئینهاي نوترکیب مورد توجه قرار گرفته است.
هدف: هدف از مطالعه، ساخت اریتروپوئتین پگیله شده است که داراي خواص فارماکوکینتیکی بهتري باشد.
روش: ابتدا آنالوگ سیستئینی توسط روش "جهشزایی نقطهاي" از روي cDNA اریتروپوئتین ساخته و وارد حامل بیانی شد. سپس این سازه به روش لیپوفکشن وارد سلولهاي CHO/dhfr- شد و به روش تکثیر با متوترکسات، کلونهاي با بیان بالا انتخاب شدند. در ادامه روش "کروماتوگرافی تمایلی" براي خالص سازي آنالوگ سیستئینی استفاده شد. سپس پگیلاسیون اختصاصی با "مالئیمید- پلیاتیلنگلیکول"، از طریق سیستئین آزاد جایگزین شده انجام شد. سرانجام پس از خالصسازي توسط "ژل فیلتراسیون"، فعالیت زیستی آنالوگ پگیله شده بروي رده سلولی UT7 مطالعه شد.
نتیجه: نتایج نشان داد که آنالوگ پگیله شده داراي فعالیت زیستی مناسبی بود. به عبارت دیگر، جایگزین کردن سیستئین و یا اتصال پلیاتیلنگلیکول اثر منفی بر فعالیت زیستی آن نداشته است.
مقدمه:
اریتروپوئتین - EPO - نقشی مهمی در تولید و تمایز ردههاي پیشساز اریتروئید به گلبولهاي قرمز بالغ تحت شرایط هیپوکسی به عهده دارد. نقص در تولید EPO باعث کاهش تعداد گلبولهاي قرمز خون و ایجاد کمخونی میشود . - 1 - rhEPO موجود در بازار یک پروتئین با گلیکوزیلاسیون بالا - بیش از %40 وزن ملکولی - است که از 165 باقیمانده آمینواسیدي با وزن ملکولی تقریبی 35kDa تشکیل شده است
به علت وجود تغییرات پس از ترجمهاي قابل توجه، بیان این پروتئین به صورت تجاري در سلولهاي تخمدان هامستر چینی - CHO - و کلیه نوزاد هامستر - BHK - صورت میگیرد rhEPO . - 1 - داراي نیمه عمري حدود 4 تا 13 ساعت بوده و به منظور داشتن اثرات درمانی باید 2 تا 3 بار در طول هفته تزریق شوند که این امرعلاوه بر افزایش هزینههاي درمانی باعث افزایش تزریقهاي وریدي میگردد. به همین دلیل، علاقه زیادي براي دستیابی به یک فرم پایدارتر از rhEPO وجود دارد
یک راه تایید شده براي ارتقاء خصوصیات فارماکوکنیتکی فرآوردههاي بیولوژیک پگیلاسیون می باشد . - 4 - مسئله اساسی در پگیلاسیون پروتئینها تولید مخلوط هتروژن و کاهش فعالیت بیولوژیک، در نتیجه پگیلاسیون غیر اختصاصی میباشد . - 5 - به عنوان مثال فرم پگیله شدة اریتروپوئتین عرضه شده به بازار، به صورت هتروژن بوده و پلیمر پلیاتیلنگلیکول به لیزینهاي شمارة 54 و 42 در پروتئین متصل شدهاند. این فرم نیمه عمري بیش از 100 ساعت دارد که کارایی پگیلاسیون را در افزایش نیمه عمر اریتروپوئتین نشان میدهد. اما از آنجائیکه این نوع پگیلاسیون غیراختصاصی میباشد، عیب عمدة این ترکیب هتروژن بودن آن میباشد. بخاطر همین در این تحقیق، روش سیستئین پگیلاسیون براي افزایش نیمه عمر اریتروپوئتین و همچنین هموژن بودن محصول نهایی انتخاب شده است.
مواد و روشها:
cDNA مربوط به EPO در پلاسمید pTZ57R/T کلون شد و یک توالی His-tag به -Cترمینال و یک توالی kozak به -Nترمینال cDNA با استفاده از پرایمرهايF1 وR1 اضافه شد. جایگزین کردن اسید گلوتامیک شماره 31 با سیستئین با تکنیک جهش زایی نقطهاي و با استفاده از پرایمرهاي F2 و R2 انجام شد
جدول:1 پرایمرهاي مورد استفاده در ساخت سازة بیانی آنالوگ سیستئینی.
انجام واکنش هاي PCR با آنزیم پلیمراز - fermentase - Pfu براي جلوگیري از جهش هاي ناخواسته صورت گرفت. ژن جهش یافته در حامل بیانی - Invitrogen - optiCHO کلون شد. سرانجام صحت سازه جدید ژنی با استفاده از تکنیک توالییابی تایید شد. براي بیان سلولهاي - ATCC No . CRL-9096 - CHO/dhfr- در محیط کشت DMEM حاوي %10 از FBS و هیپوگزانتین و تیمیدین کشت داده شدند. سازه نهایی پس از خطی کردن با آنزیم - Fermentas - SspI، به وسیله کیت Lipofectamin - Invitrogen - بدرون سلولها ترانسفکت شد و کلونها در محیط کشت انتخابی - محیط بدون نوکلئوزید - انتخاب شدند.
بیان پروتئین در کلونهاي حاصله با استفاده از روش تکثیر ژنی توسط متوترکسات افزایش یافت. سرانجام بیان با استفاده از SDS-PAGE - ژل - 12% و وسترن بلات با استفاده از آنتیبادي منوکلونال موشی علیه rhEPO و IgG بز کونژوگه با - GeneTex Inc - HRP تایید شد. تخلیص پروتئین بیان شده با استفاده از ستون GE - His trap - Healthcare صورت گرفت. واکنش پگیلاسیون در دماي اتاق و تحت گاز نیتروژن انجام شد.
مقادیر 30 برابر مولی از - Tris [2-carboxyethyl] phosphine- HCl - TCEP و - SunBioInc - mPEG-maleimide با وزن ملکولی 30 کیلودالتن به محلول آنالوگ E31C با غلظت 250 μg/mL در بافر تریس 50 میلی مولار با PH برابر 8 اضافه و به مدت 3 ساعت انکوبه شد. آنالوگ پگیله شده به روش "ژل فیلتراسیون" تخلیص شده و فعالیت بیولوژیکی آن بروي رده سلولی UT7 بر طبق Biritish Pharmacopea 2010 انجام شد. دادههاي حاصله از لحاظ آماري به روش ANOVA مورد بررسی قرار گرفته و مقادیر داراي ارزش p کمتر از 0.05 معنیدار تلقی شدند.
نتایج و بحث:
اضافه کردن توالی His-tag، توالی Kozak و جایگزینی اسید آمینه گلوتامیک اسید با اسیدآمینه سیستئین بطور توسط روش Overlap Extension PCR با پرایمرهاي مربوطه انجام گرفت - شکل cDNA . - 1a جهش یافته داخل حامل بیانی OptiVEC کلون شد و صحت سازه با استفاده از هضم آنزیمی و توالی یابی DNA تایید شد. سازه نهایی پس از خطی کردن به درون سلولهاي CHO/dhfr- ترانسفکت شد. سلولهاي بیان کننده در محیط کشت انتخابی ظاهر شدند. کلونهاي حاصله تحت تیمار با غلظتهاي افزایندة متوترکسات قرار گرفته و کلونهاي با بیان بالا توسط روش الیزا انتخاب شدند. وجود کدون سیستئین جایگزین شده توسط روش RT-PCT و توالی یابی تایید شد. تعیین هویت آنالوگ سیستئینی بیان شده توسط آنتیبادي منوکلونال موشی ضد اریتروپوئتین تایید شد - شکل . - 1c خالصسازي آنالوگ بیان شده توسط افینتی کروماتوگرافی با استفاده از نیکل انجام شد
شکل - a - :1 ایجاد جهش نقطهاي به روش PCR جهت جایگزینی اسیدآمینه گلوتامیک اسید با سیستئین - ستون :2 قطعه اول cDNA اریتروپوئتین - 200bp - ، ستون :4 قطعه دوم cDNA اریتروپوئتین - 400bp - و ستون cDNA :6 کامل اریتروپوئتین حاوي جهش مربوطه - b - - ~ 600bp - خالص سازي آنالوگ سیستئینی بیان شده توسط کروماتوگرافی تمایلی و - c - تعیین هویت آنالوگ سیستئینی به روش وسترن بلات با استفاده از آنتیبادي منوکلونال موشی.
واکنش پگیلاسیون طبق روش ذکر شده انجام و آنالوگ پگیله توسط روش ژل فیلتراسیون از فرم غیر پگیله جدا شد - شکل. - 2a نتایج آزمون بروي سلولهاي UT7 نشان داد که EC50 آنالوگ پگیله شده - 0.54 ± 0.08 - مشابه rhEPO - 0.52 ± 0.04 - و آنالوگ پگیله نشده - 0.53 ± 0.03 - میباشد
شکل - a - :2 آنالوگ پگیله شده پس از خالصسازي توسط ژل فیلتراسیون - ستون :1 پس از یک ساعت انکوباسیون با پلیمر و ستون :2 پس از سه ساعت انکوباسیون با پلیمر - - b - مقایسه فعالیت زیستی rhEPO، آنالوگ غیر پگیله و پگیله شده بروي سلولهاي .UT7
