بخشی از مقاله
چکیده:
آنﱵ بادیهاي نوترآیب مولکوﳍاي جدیدي بوده آه به وسیله تکنیکهاي مهندسی ژنتیک به اشکال ﳐتلف - عموماً به فرم Fab یا - scFv درون سلوﳍاي باآﱰي، ﳐمر، گیاهان، و سلوﳍاي پستانداران ساخته می شوند. با توجه به اینکه این آنﱵ بادیها امروزه استفاده هاي زیادي در تشخیص آنﱵ ژهناي ﳐتلف دارند، هدف از اﳒام این ﲢقیق دستکاري یک فاژمید آنﱵ بادي وآتور تولید آنندة آنﱵ بادیهاي نوترآیب بوده است آه بتوان با قرار دادن ژن EGFP در آن، این دسته از آنﱵ بادیها را به آسانی به فرم آنﱵ بادي نوترآیب فلورسنت تولید ﳕود. بدین منظور، ضمن تکثﲑ ژن فوق ﳏل برش آنزﳝهاي برشی Bsp120I و NotI ﳘچنﲔ پپتید اتصال دهنده - linker - به دو انتهاي ژن EGFP افزوده شده، سپس این ژن در داخل وآتور pIT2 آلون گردید. وآتور حاصله به داخل سلول E.coli سویهHB2151 منتقل گردید. با اﳒام تواﱄ یابی و اطمینان از حصول اهداف مورد نظر، این وآتور جدید ﲢت عنوان pGK-29 نامیده شد. در هنایت فعالیت وآتور با مشاهدة سلوﳍا توسط میکروسکوپ فلورسنت و اﳒام تستهاي SDS-PAGE، Immunoblots وELISA مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این ﲢقیق نشان داد آه اولاً ژن فوق بدون هیچگونه مشکل خاصی در داخل وآتور قرار گرفته و ﳘچنﲔ وآتور جدید توانائی تولید آنﱵ بادیهاي فلورسنت نوترآیب را دارا می باشد. آنﱵ بادیهاي فلورسنت نوترآیب تولید شده در قسمت سیتوپلاسم باآﱰي قرار داشته و توانائی شناسائی آنﱵ ژن را دارا می باشند.
مقدمه:
آنﱵ بادیها اجزائی از سیستم اﳝﲏ بدن مهره داران می باشند آه با اختصاصیت بسیار زیاد قادر به شناسائی و اتصال به مولکوﳍاي آنﱵ ژن می باشند. در گذشته تولید آنﱵ بادیها جهت استفاده هاي تشخیصی و یا درمانی تنها در بدن حیوانات امکان پذیر بوده است آه به دو فرم آنﱵ بادیهاي پلی آلونال و منوآلونال اﳒام پذیر بوده است. در فن آوري جدید امکان تولید آنﱵ بادیها در ﳏیط خارج از بدن حیوانات و در داخل آزمایشگاه با روشهاي مهندسی ژنتیک در داخل سلوﳍاي باآﱰي، ﳐمر، گیاهان، سلوﳍاي حشرات و ﳏیط آشت سلوﱄ فراهم آمده است . - 4 - به این دسته از آنﱵ بادیها آنﱵ بادیهاي نوترآیب اطلاق می شود و خصوصیت اتصال به آنﱵ ژن در آهنا ﳘانند آنﱵ بادیهاي منوآلونال می باشد. در سطح ژنی، آنﱵ بادیهاي نوترآیب توانائی اتصال به پروتئﲔ هاي ﳐتلف ﲟنظور ساخت آنﱵ بادیهاي دوآاره - Bifunctional - را دارا می باشند . - 1 -
از ﲨله این پروتئﲔ ها، پروتئﲔ فلورسنت سبز - GFP - می باشد آه از آن می توان جهت نشاندار آردن آنﱵ بادیهاي نوترآیب استفاده ﳕود 1 - و. - 2 آنﱵ بادیهاي فلورسنت در مطالعات اﳝینوهیستوشیمی، مشاهده مکان حضور پاتوژن ها یا پروتئﲔ هاي گوناگون در بافت هاي ﳐتلف و بررسی ساختار سلوﱄ با استفاده از تکنیک اﳝونوفلورسنس مورد استفاده قرار می گﲑند. تاآنون موارد ﳏدودي از آنﱵ بادیهاي نوترآیب به ژن GFP و یا EGFP متصل شده و پروتئینهاي شیمریک حاصله حالت فلورسنت داشته اند، اما در موارد فوق منجر به ساخت وآتوري آه بتوان جهت ساخت انواع ﳐتلف آنﱵ بادیهاي فلورسنت نوترآیب از آن استفاده ﳕود، نشده است. بنابراین در این ﲢقیق اقدام به ساخت وآتوري گردیده است است آه در آن ژن EGFP جزء لاینفک آن بوده و می توان با اﳒام تکنیک سادة Recloning از آن جهت تولید انواع ﳐتلفی از آنﱵ بادیهاي فلورسنت نوترآیب استفاده ﳕود.
مواد و روشها:
براي ساخت وآتور تولید آنندة آنﱵ بادیهاي فلورسنت نوترآیب، تصمیم گرفته شد تا با قرار دادن ژن EGFP درون آنﱵ بادي فاژمید وآتور pIT2 متعلق به Tomlinson I&J libraries، وآتوري طراحی گردد آه داراي شرایط ذیل باشد: ژن - GFPmut1 - EGFP توسط تواﱄ یک پپتید متصل کننده متشکل از چهار اسیدآمینه گلایسﲔ - Gly4 - ، به قسمت 3′ ژن آنﱵ بادي نوترکیب متصل شود، ژن آنﱵ بادي نوترکیب توسط عمل Recloning به راحﱵ قابل جاﲜائی باشد، هیچگونه تغیﲑي در چهارچوب ترﲨه ORF مربوط به ژن آنﱵ بادي فلورسنت نوترکیب مشاهده نشود و هیچ اختلاﱄ نیز در اجزاي ژنتیکی وکتور از ﲨله پروموتور، تواﱄ سیگنال، Tagها و تواﱄ خاﲤه دهنده رخ ندهد. براي افزودن ژن مذآور، طراحی پراﳝرهاي p1 و p2 بنحوي اﳒام گردید آه بﲔ ژن EGFP و ژن آنﱵ بادي، تواﱄ Gly4 قرار گرفته و در آنار آن مکان برش آنزﳝی NotI اﳚاد گردد و ﳘچنﲔ در ﲰت دیگر ژن EGFP مکان برشی آنزﱘ Bsp120I بوجود آید. این طراحی منجر گردید آه ژن EGFP بعد از آلون شدن از وآتور جدا نگردیده و امکان تعویض آنﱵ بادیهاي ﳐتلف از طریق مکاهناي برش آنزﳝی NotI و NcoI فراهم شود.
به منظور امکان پذیر شدن عمل جاﲜائی ژن مربوط به scFv، از ژن EGFP اي استفاده گردید آه قبلاً مکان برش آنزﱘ - NcoI توسط خلیلی یزدي و گلچﲔ - از روي آن حذف شده بود. در مرحله بعد با بکار گﲑي این پراﳝرها و با استفاده از آنزﱘ Pfu ، ژن مورد نظر تکثﲑ گردید. پس از خالص سازي، ﳏصول PCR ابتدا با آنزﱘ Bsp120I و سپس با آنزﱘ NotI بریده شد. وآتور pIT2 فقط با آنزﱘ NotI برش داده شد و جهت جلوگﲑي از اتصال ﳎدد آن، توسط آنزﱘ آلکالﲔ فسفاتاز فسفر انتهاي ناحیه 5′ حذف گردید. وآتور و قطعه تکثﲑ یافته با نسبتهاي مناسب با یکدیگر ﳐلوط شده و توسط آنزﱘ T4 ligase دو قطعه به هم اتصال یافتند. پس از انتقال وآتور جدید به سلول E.coli سویه HB2151 توسط روش شوك حرارتی، سلوﳍاي رشد یافته بر روي پلیت هاي ترانسفورماسیون با استفاده از تکنیکهاي آلونی PCR و تواﱄ یابی DNA مورد ارزیابی قرار گرفتند.
در مراحل بعد عملکرد این وآتور جدید ارزیابی گردید. ابتدا با رشد آلﲏ حامل این وآتور و فراهم ﳕودن شرایط مناسب بیان پروتئﲔ شیمریک، آنﱵ بادي فلورسنت ضد پروتئﲔ BSA تولید گردید و سلوﳍائی آه بیان پروتئﲔ در آهنا القاء شده بود با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت و با فیلﱰهاي مربوط به FITC مشاهده شدند. سپس پروتئﲔ موجود در قسمتهاي ﳐتلف سلوﱄ - سیتوپلاسم، پریپلاسم و ﳏیط آشت - استخراج شده و فعالیت و مقدار نسﱯ آنﱵ بادي فلورسنت ساخته شده در این قسمتهاي سلوﱄ با آزمایش ELISA و با استفاده از آنﱵ بادي ضد c-myc اندازه گﲑي شد. در هنایت جهت خالص سازي پروتئﲔ مورد نظر از روش آروماتوگراﰲ میل خالص شده با روش هاي SDS-PAGE ترآیﱯ IMAC استفاده گردید و پروتئﲔ و وسﱰن بلاتینگ ردیابی گردید.
نتایج و ﲝث:
نتایج تکثﲑ ژن EGFP با پراﳝرهاي p1 و p2 و مشاهدة ﳏصول PCR بر روي ژل آگارز نشان دهندة باند مورد انتظار بود بنحویکه هیچگونه باند اضافه دیگري مشاهده نگردید. این قطعه پس از برش یافﱳ با آنزﳝهاي NotI و Bsp120I در درون وآتور pIT2 آلون گردید و با انتقال آن به داخل سلول E.coli و بر روي پلیت هاي آشت حاصل از ترانسفورماسیون، تعدادي آلونی باآﱰیائی مقاوم به آمپی سیلﲔ رشد یافتند. ارزیابی تعدادي از این آلونی ها با تکنیک آلونی PCR با استفاده از پراﳝرهاي p1 ،p2 و pelB نشان داد آه در چهار آلونی از آلونی هاي فوق ژن مورد نظر در جهت مناسب درون وآتور قرار گرفته است. ﳘچنﲔ با اﳒام عمل هضم آنزﳝی و اﳒام عمل Recloning از قابلیت جاﲜائی ژن مربوط به scFv در این وآتورها اطمینان حاصل آمد. نتایج تواﱄ یابی DNA این 4 آلونی نشان داد آه آلون ﴰارة 29 داراي ﲤامی موارد مورد نظر می باشد. پس از اطمینان از اینکه وآتور ﴰارة 29 آاملا مطابق موارد پیش بیﲏ شده بود ﲢت عنوان pGK-29 نامگذاري شد - تصویر ﴰارة . - 1
بررسی فعالیت وآتور مذآور نشان داد سلوﳍاي حاوي این وآتور آاملاً فلورسنت می باشند. نتایج آنالیزهاي SDS-PAGE و وسﱰن بلاتینگ با استفاده از آنﱵ بادي anti-c-myc وجود باندي در حدود 60kDa مربوط به این پروتئﲔ را تائید ﳕود. نتایج ELISA نشان دهندة ﳏل بیان پروتئﲔ در ناحیه سیتوپلاسم باآﱰي بود. ﳘچنﲔ این آزمایش فعالیت آنﱵ بادي در شناخت آنﱵ ژن خود، بعد از اتصال به مولکول EGFP را تائید می ﳕاید. نتایج این ﲢقیق تائید آنندة آارهاي اﳒام شده قبلی توسط Casey و ﳘکارانش - 1 - و ﳘچنﲔ Morino و ﳘکارانش - 2 - می باشد، پس از اتصال GFP به scFv، این مولکول ﳘچنان حالت فلورسنت خود را حفظ ﳕوده و در عﲔ حال تغیﲑ فاحشی در میزان ﲤایل جذبی آنﱵ بادي نسبت به آنﱵ ژن خود اﳚاد نگردید. ﳕودار ﴰارة :1 نتایج آزمایش ELISA آه ﳏل ساخت آنﱵ بادي نوترآیب فلورسنت و فعالیت آن در شناخت آنﱵ ژن را نشان می دهد =C - سیتوپلاسم، =P پریپلاسم، =M ﳏیط آشت و C9 آنﱰل منفی
آنﱵ بادي می باشند - .
