بخشی از مقاله
چکیده:
میکوتوکسﲔ داکسی نیوالنول - DON - که توسط قارچ Fusarium graminearum تولید می شود ﳑانعت کننده سنتز پروتئﲔ در یوکاریوت هاست و به عنوان فاکتور تشدید بیماریزایی عمل می کند. اتصال به پروتئﲔ ریبوزومی - RPL3 - L3 در گندم از بیان پروتئﲔ های وابسته به مقاومت جلوگﲑی کرده و باعث تشدید بیماریزایی قارچ مولد می شود. از مکانیسم های افزایش مقاومت سلولی به این سم، بیان بالا یا تغیﲑ در اسید آمینه های خاص در پروتئﲔ RPL3 است. بررسی الگوی بیان این پروتئﲔ در گندم زراعی در حضور یا عدم حضور DON و ﳘچنﲔ بررسی های اﳝونولوژیک گیاهان ترارﳜت شده با ژن های خارجی RPL3، به آنتی بادی بر علیه این پروتئﲔ نیاز دارد. به ﳘﲔ منظور تولید آنتی سرم و آنتی بادی پلی کلونال پروتئﲔ ریبوزومی L3 برای اولﲔ بار در این مطالعه مورد بررسی قرار گرفته است. کلمات کلیدی: بلایت فوزاریومی سنبله گندم - - FHB - پروتئﲔ ریبوزومی – - L3 آزمون های مولکولی پس از ترارﳜتی
مقدمه:
بیماری بلایت فوزاریومی سنبله - FHB - 1 یا اسکب - 2 در گندم، جو و چاودار - از بیماری های مهم غلات دانه ریز در بسیاری از مناطق دنیا از ﲨله ایران است 1 - و. - 3 قارچ مولد، Fusarium graminearum ، نه تنها باعث کاهش چشمگﲑﳏصول می شود بلکه به سبب تولید میکوتوکسﲔ های ﳐتلف و ﲡمع آن ها در دانه ها باعث کاهش کیفیت ﳏصول برداشت شده می شود 3 - و. - 4 میکوتوکسﲔ های فوزاریومی به شرایط ﳏیطی حاکم بعد از برداشت و مراحل تولید ﳏصولات غذایی از ﲨله ﲣمﲑ و پخﱳ به شدت مقاوم بوده و مصرف آهنا موجب بیماري های حاد و مزمن گوارشی، اختلالات عصبی و سرکوب سیستم اﳝنی در انسان و حیوانات می شود 3 - و. - 5 یکی از مهمﱰین این میکوتوکسﲔ ها تریکوتسﲏ بنام دی اکسی نیوالنول - DON - 3 است که از طریق اتصال به پروتئﲔ ریبوزومی - RPL3 - 4 L3 باعث ﳑانعت از سنتز پروتئﲔ ها در یوکاریوت ها می شود DON . - 6 - با جلوگﲑی یا به تاخﲑ انداخﱳ بیان پروتئﲔ های وابسته به مقاومت5 - PR - باعث تشدید بیماریزایی قارچ مولد می شود 7 - و. - 8 بیان بالای نسخه های نوع وحشی و یا جهش یافته های RPL3 باعث افزایش مقاومت سلول گیاه به این میکوتوکسﲔ می شود 9 - ،10و. - 11 در بررسی های قبلی مشخص شد که گندم زراعی دارای شش ﳘولوگ از پروتئﲔ RPL3 می باشد 2 - و. - 12 بررسی تغیﲑات الگوی پروتئینی ﳘولوگ های ﳐتلف RPL3 در حضور یا عدم حضور DON و ﳘچنﲔ چگونگی بیان ژن های جهش یافته یا طبیعی آن در گیاهان ترارﳜت از طریق روش هایی نظﲑ وسﱰن بلات، احتیاج به آنتی بادی پروتئﲔ مناسب و اختصاصی برای RPL3 دارد که این هدف در پروژه حاضر مد نظر قرار گرفت.
مواد و روش ها:
توالی cDNARPL3 گندم موجود در بانک ژن NCBI - با ﴰاره دسﱰسی - AY347533 برای بدست آوردن توالی پروتئﲔ آن مورد استفاده قرار گرفت. با استفاده از نرم افزار DNAStar - Laser gene - اندازه پروتئﲔ ﲣمﲔ زده شد و توالی آن جهت شناسایی و اطمینان از وجود نواحی اﳝونولوژیک مورد بررسی قرار گرفت. آغازگرهای اختصاصی با استفاده از ﳘﲔ توالی طراحی گردیدند. RNA تام از بافت برگ گندم و با استفاده از کیت RNeasy Plant Mini کمپانیQIAGEN استخراج گردید و در برنامه RT-PCR با استفاده از Pfu polymerase - Fermentase - جهت تکثﲑ و جداسازی cDNA این ژن مورد استفاده قرار گرفت. پس از توالی یابی و اطمینان از صحت آن، cDNA حاصله در حامل های بیانی pET21 - Invitrogen - وpET30 ﳘسانه سازی گردید و سازه به دست آمده به باکﱰی E. coli - DE3 - منتقل گردید. القای تولید پروتئﲔ در شرایط ﳐتلف دمایی - - 28œC, 37œC، غلظت های متفاوت - 0.5 mM, 0 .8 mM, 1 mM - IPTG و مراحل ﳐتلف - OD600 =0.4 , 0.6, 0.8, 1 - مورد بررسی قرار گرفت.
رسوب حاصل از یک لیﱰ ﳏیط القا شده در 50 mL بافر 0.5 M TE حل گردید و با استفاده از امواج فراصوت باکﱰی ها کافت شده و اجسام اینکلوژن6 پروتئﲔ مورد نظر در ﳏیط رها شدند. برای خالص سازی پروتئﲔ از ژل آکریل آماید با ضخامت بالا استفاده شد. به این ترتیب پروتئﲔ القا شده از روی این ژل توسط بافری شامل 0.1 mM EDTA, 0.15 mM NaCl, 5 mM DDT, 0. 1% SDS 50 mM Tris- Cl, ، استخراج گردید. جهت اطمینان از خلوص پروتئﲔ، مقداری از آن روی ژل مشاهده شد. غلظت پروتئﲔ توسط تکنیک برادفورد و طیف سنجی مشخص شد.
نتایج و ﲝث:
ﳏصولات RT-PCR قطعات1.2 Kb بودندکه با اندازه موردنظر تطابق داشتند. توالی یابی این ﳏصولات عدم وجود جهش در توالی cDNA تکثﲑ یافته را نشان داد. سازه حاصل از ﳘسانه سازی cDNA ژن RPL3 در پلاﲰید pET21 درهیچ شرایطی قادر به تولید پروتئﲔ نبود، اما سازه حاصله از ﳘسانه سازی این توالی در pET30 در شرایط 37œC و OD600 = 0.4 در زمان القا، پس از 9 ساعت از زمان القا بیشﱰین مقدار پروتئﲔ را تولید کرد. غلظت IPTG بر مقدار پروتئﲔ تولیدی تاثﲑ گذار نبود بنابراین از غلظت 0.5 mM آن استفاده گردید. با مشاهده پروتئﲔ های استخراج شده از روی ژل پلی اکریل آماید از خلوص وعدم آلودگی با دیگر پروتئﲔ ها اطمینان حاصل شد و اندازه آن با اندازه مورد نظر مطابقت داده شد. برای تولید آنتی بادی 400-1000 ʽg از پروتئﲔ خالص در طی 4 مرحله به خرگوش تزریق خواهد شد و سپس پلاﲰای خون خرگوش توسط تکنیک های Dot blot و Western blot بررسی خواهد شد. با توجه به مناطق آنتی ژنیک پیش بینی شده در ساختمان پروتئﲔ، تولید آنتی بادی پلی کلونال با غلظت بالا انتظار می رود. این آنتی بادی در بررسی های آینده بر روی پروتئﲔ RPL3 گندم - ارقام حساس و مقاوم به - FHB بکار خواهد رفت.
