بخشی از مقاله
چکیده
شناسایی ژنوتیپهاي مقاوم به ورم پستان در گاو شیري از اهمیت بهداشتی و اقتصادي فراوانی برخوردار است. لاکتوفرین یکی از مهمترین ترکیبات ضد میکروبی طبیعی موجود در شیر گاو است که سبب جلوگیري از رشد و از بین بردن پاتوژنها میشود. از این رو لاکتوفرین به عنوان مارکر ژنتیکی مقاومت به ورم پستان مطرح شده است.
هدف از انجام این مطالعه طراحی و ارزیابی روش سریع و ارزان جهت غربالگري جمعیت گاوهاي شیري از جهت وجود پلیمورفیسم در ناحیه GCbox پروموتور ژن لاکتوفرین است. بر همین اساس روش PCR-RFLP جهت تفریق انواع ژنوتیپهاي موجود در این ناحیه مورد استفاده قرار گرفت. این روش به صورت دقیق قادر به تفکیک انواع ژنوتیپهاي موجود بود و به علاوه نتایج این روشکاملاًبا روش تعیین توالی DNA تطابق داشت. بنابراین این روش به عنوان یک روش قابل اطمینان و سریع جهت استفاده در برنامههاي اصلاح نژادي در گاو شیري معرفی میگردد.
مقدمه
با افزایش تولید شیر جهت پاسخ به نیازهاي روزافزون جمعیت انسانی در دهههاي اخیر حساسیت به بیماري ورم پستان در گاو شیري افزایش یافته است. از آن جایی که این گاوهاي پرتولید حساسیت بیشتري به ورم پستان نشان میدهند، شناسایی ژنوتیپ مقاوم به ورم پستان از اهمیت فراوانی برخوردار است تا به موازات انتخاب گاوهاي پر تولید، گاوهاي مقاوم به ورم پستان شناسایی و در جمعیت تکثیر شوند . - 3 - تعداد 60 جایگاه ژنی موثر در حساسیت و مقاومت به ورم پستان، تخمین زده میشود.
در این میان فقط در جایگاههاي ژنی 1TLR-4، 2FEZF2، 3LTF، 4IL8RA ارتباط بین تغییر توالی ژن و مقاومت و حساسیت به ورم پستان شناخته شده است . - 7 - در میان اینها LTF یکی از مهمترین جایگاهها است که در ساخت لاکتوفرین از مهمترین ترکیبات ضد میکروبی طبیعی در شیر گاو نقش دارد. لاکتوفرین یک گلیکوپروتئین متعلق به خانواده ترانسفرین با وزن مولکولی 80 کیلو دالتون است - 1 - که داراي نقشهاي متعددي از جمله انتقال، ذخیره و اتصال به آهن است.
خاصیت باکتریواستاتیک آن مربوط به اتصال قوي به آهن و خارج ساختن آهن از دسترس باکتريها است و از طرفی ناحیه N ترمینال آن داراي خاصیت باکتري سیدال نیز می باشد 2 - و. - 8 بنابراین بررسی میزان بیان و ساختار ژن لاکتوفرین به عنوان یک مارکر ژنتیکی مقاومت گاو به ورم پستان داراي اهمیت فراوانی است. مطالعات اخیر نقش نواحی تنظیمی در پروموتور ژن لاکتوفرین در گاو را مشخص نموده است، به صورتی که حذف توالی TATA box و Sp1 از پروموتور سبب کاهش شدید فعالیت پروموتور میشود
توالی GCbox یک توالی غنی از نوکلئوتیدهاي گوانین و سیتوزین و محل اتصال عامل رونویسی 5Sp1 میباشد. Sp1 عامل رونویسی است که از یک طرف به توالی - GCbox - DNA و از طرف دیگر با عوامل عمومی رونویسی ارتباط برقرار میکند که در نهایت سبب قرارگیري آنزیم RNA پلیمراز II در محل صحیح رونویسی و تحریک رونوشت برداري میشود. بنابراین تغییرات در توالی GCbox در DNA سبب از دست رفتن توانایی Sp1 در اتصال به DNA میشود و در نهایت کاهش میزان رونویسی میشود
اگرچه اخیراًوجود پلی مورفیسم در نقاط مختلف از پروموتور ژن لاکتوفرین از جمله نواحی -19 در TATA box و -209 در GCbox در نژادهاي مختلف گاو شیري شناسایی شدهاند - 5 - ولی تا به حال هیچ گونه مطالعهاي جهت بررسی ارتباط بین پلیمورفیسم در نواحی تنظیمی ژن لاکتوفرین و ورم پستان در گاو شیري انجام نگرفته است. هدف این مطالعه طراحی و ارزیابی روش سریع، دقیق و ارزان جهت ژنوتیپینگ پلی مورفیسم در ناحیه GCbox ژن لاکتوفرین جهت بکارگیري در برنامههاي غربال گري جمعیت گاوهاي شیري است.
مواد و روشها
از تعداد 20 گاو شیري نژاد هولیشتاین میزان 2 میلیلیتر خون از ورید دمی در لولههاي حاوي ماده ضد انعقاد EDTA گرفته شد. نمونهها در کنار یخ به آزمایشگاه ارسال گردید. میزان 50 میکرو لیتر از هر نمونه جهت استخراج DNA مورد استفاده قرار گرفت. استخراج DNA با استفاده از کیت استخراج - Rapid Genomic DNA Isolation Kit - DNA شرکت MBST و مطابق با توصیه شرکت سازنده انجام گرفت.
واکنش PCR
واکنش PCR به حجم نهایی 25 میکرو لیتر حاوي 2 میکرو لیتر از DNA الگو، پرایمرهاي رفت و برگشت LFR=5´.GACAGCCTTTGGGCACTTAG.3´ - و - LFR=5´.GGGTAGGACAGAAGCGACAG.3´، بافر PCR، Mgcl2، dNTPs و آنزیم Taq پلی مراز انجام شد. شرایط سیکل حرارتی شامل واسرشت سازي اولیه 94 ͦC به مدت 5 دقیقه و 35 سیکل واسرشت سازي 94 ͦC به مدت 1 دقیقه، اتصال 57/8 ͦC به مدت 45 ثانیه و گسترش 72 ͦC به مدت 1 دقیقه و در پایان گسترش نهایی 72 ͦC به مدت 7 دقیقه انجام شد. تمامی نمونهها قبل از هضم آنزیمی جهت ارزیابی محصول بر روي ژل آگاروز 1/5 درصد الکتروفورز شد.
هضم آنزیمی محصولات
آنزیم محدودکننده SmaI جهت هضم ناحیه GCbox انتخاب گردید. این آنزیم قادر است توالی CCCGGG را در محل GCbox برش دهد. بنابراین هر گونه جهش در این توالی نوکلئوتیدي در GCbox موجب از دست رفتن محل برش آنزیم SmaI در محصول PCR میشود. پرایمرهاي مورد استفاده در این مطالعه طوري انتخاب شده است که علاوه بر توالی GCbox یک محل برش دیگر آنزیم SmaI را در محصول PCR شامل میشود.
از این توالی به عنوان کنترل داخلی عمل آنزیم استفاده شد. مشخصات توالی برش آنزیم SmaI و اندازه قطعات ایجاد شده در جدول - 1 - خلاصه شده است. جهت هضم محصولات PCR، 10 میکرو لیتر از محصول PCR با 2 میکرو لیتر آنزیم SmaI و 2/5 میکرو لیتر بافر تانگو 10X به همراه 10/5 میکرو لیتر آب مقطر به حجم نهایی 25 میکرو لیتر رسید. مخلوط حاصل به مدت 3 ساعت در 30 درجه سانتیگراد انکوبه گردید. سپس محصول بدست آمده حاصل از هضم
آنزیمی بر روي ژل آگاروز 1/5 درصد الکتروفورز گردید و پس از رنگ آمیزي با اتیدیوم بروماید، الگوي باندهاي حاصل تحت اشعه UV قرائت شد. به منظور تایید روش PCR-RFLP مطرح شده، تمامی نمونهها به صورت مستقیم تعیین سکانس شدند.
جدول - - 1 مشخصات توالی برش آنزیم SmaI و اندازه قطعات ایجاد پس از برش آنزیم
نتایج و بحث:
هضم آنزیمی محصولات PCR توسط آنزیم SmaI قادر به تفکیک هر سه ژنوتیپ - AA,AG,GG - در توالی GCbox بود - شکل. - 1 بعلاوه نتایج حاصل از هضم آنزیمیکاملاًبا نتایج حاصل از تعیین سکانس هماهنگی داشت - شکل . - 2 در نظر گرفتن جایگاه برش کنترل داخلی در محصول PCR جهت هضم آنزیمی موجب اطمینان از عمل آنزیم محدود کننده و تفکیک هضم ناقص از هضم کامل محصول میشود.
