بخشی از مقاله
چکیده :
یکی از مناسبترین ناقل ها براي انتقال و بیان ژن هاي نوترکیب ناقل هاي لنتی ویروسی است. این انتخاب به واسطه ویژگیهاي منحصر به فرد لنتی ویروسها مانند توان ادغام در ژنوم سلول هاي تمایز یافته و اختصاصی، قدرت انتقال به سلولها در مرحله اینترفاز و کارایی ناقل براي انتقال ژن به روش درون تنی است. هدف این تحقیق طراحی و ساخت ناقل لنتی ویروسی فاقد عملکرد اینتگراز است که بتواند با کارائی بالا وارد سلول شده ولی قادر به ادغام شدن در ژنوم سلول نباشد. سازه ژنی وارد شده در ناقل ویروسی پس از ورود به هسته سلول با استفاده از پدیده نوترکیبی همسان جایگزین ژن مورد نظر می شود.
مقدمه :
ناقلین لنتی ویروسی مشتق از ویروس HIV-1 نسبت به دیگر ناقلین رتروویروسی داراي ساختاري پیچیده می باشند و به عنوان یکی از بهترین ناقلین در انتقال ژن بخصوص براي ژن درمانی مطرح هستند. ناقلین لنتی ویروسی که براي انتقال و بیان ژن و نیز تولید ویروس در سلول هاي تولید کننده به کار می روند حداقل به صورت سه ساختار پلاسمیدي مختلف و مجزا از یکدیگر مورد استفاده قرار می گیرند.
این ناقلین شامل ناقل انتقالی، ناقل بسته بندي ویروسی شامل ژنهاي gag, pol , env و ناقل غشائی حامل ژن vsvs-g میباشند. بعضی از محققین استفاده از ناقل چهارم که داراي ژن rev است را نیز پیشنهاد می کنند. ناقل انتقالی اصلی ترین و مهمترین ناقل است که داراي ژن هدف و یک ژن گزارشگر می باشد. این دو ژن در بخش ترانس ناقل پس از حذف ژن هاي این ناحیه در آن قرار می گیرد. کارائی ناقل هاي لنتی ویروسی براي ارائه ژن به سلول بالا است. در اغلب این ناقل ها جایگزین شدن ژن مورد نظر در ژنوم به صورت تصادفی صورت می گیرد که این مسئله می تواند باعث خاموش شدن ژنهاي مفید و یا فعال شدن ژنهاي مضر گردد
مواد و روش ها : مجموعه پلاسمید هاي سازنده لنتی ویروس pLP1، pLP2 و - Invitrogen - pLP-VSV-G تهیه گردید. کلیه دستکاریهاي مولکولی از قبیل تخلیص پلاسمید و DNA، کلونینگ و واکنش هاي آنزیمی بر اساس دستورالعمل شرکت هاي سازنده کیت انجام شد. تهیه همه آنزیمهاي اندونوکلئاز با اثر محدود و T4 DNA لیگاز از شرکت فرمنتاز تهیه و ساخت آغازگرها نیز در شرکت ژن فن آوران انجام شد.
ایجاد جهش در ژن اینتگراز
ژن اینتگراز در انتهاي مجموعه gag-pol در پلاسمید pLP1 واقع است. براي جهش در این ژن و براي از بین بردن عملکرد آن در ناحیه دومین مرکزي اینتگراز با استفاده از روش Overlap extension PCR جهشی در کدون اسید آمینه D64 ایجاد کرده و کد ژنتیکی اسید آمینه آسپارتیک اسید به کدون والین تغییر داده شد. با استفاده از نرم افزار Gene runner و بررسی توالی ژن اینتگراز در پلاسمید pLP1 آغازگر هاي مناسب طراحی شد
جدول :1 آغازگرهاي مورد استفاده در ایجاد جهش در ژن اینتگراز
ابتداء با آغازگرهاي F1، R1 int- و همچنین F2 int-، R2 واکنش PCR انجام شد. محصولات 1 PCR و 2 پس از الکتروفورز از ژل آگارز استخراج گردید. سپس قطعه DNA حاصل تکثیر شد. واکنش Overlap extension PCR با استفاده از محصول PCR 1 و 2 به عنوان الگو انجام و محصول Overlap extension PCR از ژل آگارز استخراج گردید.
کلون کردن محصول PCR نهائی در پلاسمید pLP1
پلاسمید pLP1 و محصول PCR مرحله نهائی Overlap extension توسط آنزیمهاي برش دهنده اختصاصی AgeI و AflII هضم آنزیمی شدند. پس از الکتروفورز، باند مربوطه بریده و DNA آن استخراج شد. واکنش اتصال بین آنها انجام و محصول واکنش اتصال بین آنها انجام و محصول واکنش اتصال بهE. coli Top10 F̒ منتقل شد. کلون هاي بدست آمده با آنزیمهاي AgeI و AflII هضم آنزیمی شدند و براي تایید جهش ایجاد شده در موقعیت D64 تعیین توالی شد.
تولید لنتی ویروس اینتگراز طبیعی و جهش یافته در رده سلولی 293T
دو مجموعه پلاسمید بسته بندي شامل pLP1 طبیعی و جهش یافته، pLP2 و pLP/VSV-G به همراه پلاسمید انتقالی حاوي ژن گزارشگر gfp با استفاده از دستورالعمل مربوطه جهت تولید ویروس به داخل سلول 293T منتقل شد.
تراریختی سلولهاي 293T با ویروسهاي ایتتگراز طبیعی و جهش یافته
پس از انجام تیتراسیون ویروس، با استفاده از دستورالعمل سازنده کیت سلولهاي 293T تراریخت شد. سپس به مدت سه هفته بیان پروتئین eGFP بررسی و سلولها شمارش گردید.
نتایج :
ایجاد جهش در ژن اینتگراز توسط روش Overlap extension PCR
با بهره گیري از روش فوق با استفاده از چهار آغازگر در قسمت ژن مورد نظر طوري تکثیر شدند که یک قطعه همپوشان در آن وجود داشته باشد. تکثیر قطعات DNA با آنزیم Pfu انجام شد. مرحله اول قطعات 1 و 2 حاوي بخش همپوشان که در قسمت بعدي براي Overlap extension PCR به عنوان الگو استفاده می شوند تکثیر شدند - شکل . - 1 در تکثیر نهائی در واکنش PCR قطعات 1 و 2 به عنوان الگو استفاده شده و پس از اتصال دو قطعه از طریق بخش همپوشان با استفاده از آغازگرهاي F1 و R2 و آنزیم Pfu ژن جهش یافته تکثیر شد
شکلPCR :2 قطعات اول و دوم ژن اینتگراز، –1 قطعه - 956bp - 1، -3 قطعه - 347bp - 2، 2و4 نشانگر وزن مولکولی 100bp DNA
شکل -2 اتصال دو بخش ژن اینتگراز جهش یافته، -1 نشانگر وزن مولکولی 1kb DNA
-2 محصول PCR، اتصال دو بخش ژن - 1280bp -
پس از تایید پلاسمید با هضم آنزیمی، تعیین توالی گردید و نتیجه تعیین توالی نشان دهنده ایجاد جهش در محل مورد نظر و تغییر اسید آمینه D64 به اسید آمینه والین بود.
