بخشی از مقاله
چکیده
بتالاکتوگلوبولین پروتئین اصلی بخش آب پنیر شیر نشخوارکنندگان می باشد و دارای وزن ملکولی 18200 دالتون است. برخی از آللهای ژن کدکننده بتالاکتوگلوبولین ضمن افزایش راندمان تولید شیر، روی طول دوره بارداری نیز تاثیر دارد، همچنین با کازئین و پروتئین شیر و محتوای چربی در ارتباط است. ژن موثر در توارث این پروتئین در گوسفند بر روی از ژن کدکننده بتالاکتوگلوبولین با بازده شیر و بازده چربی و محتوای چربی دارای کروموزوم شماره 3 قرار دارد. مطالعات ×نشان داده است که نوع Bهمبستگی بالایی است.
هدف از این تحقیق بررسی توزیع ژنوتیپی ژن بتالاکتوگلوبولین در گوسفند کرمانی است. در این تحقیق از100نمونه گوسفند انجام شدبطورتصادفی خونگیری گردیدو استخراج DNA بوسیله کیتDNA Purification Kit انجام شد. سپس نمونه ها با استفاده از زل آگارز %1 تعیئن غلظت شدند و به وسیله اتیدیوم برماید رنگ آمیزی گردیدند.
واکنشهای PCR با پرایمرهای مخصوص و با استفاده از کیتPCR Master Kit صورت گرفت و محصولات PCR به کمک آنزیم برشی RsaI مورد هضم آنزیمی قرار گرفت. سپس طول قطعات برش داده شده تعیین گردید. فراوانی ژنوتیپ ها، آللها و تعادل هاردی-واینبرگ توسط نرم افزار Pop gene محاسبه گردید و بنظر می رسد که روش PCR-RFLP یک روش مناسب برای تعیئن ژنوتیپ در دام می باشد.
مقدمه:
بتا لاکتو گلوبولین پروتیئن اصلی آب پنیر شیر نشخوار کنندگان است ژن کد کننده این پروتیئن روی راندمان تولید شیر و روی دوره بارداری تاثیر بسزایی دارد . این ژن در گاو و بز بر روی شماره 11 و در گوسفند بروی کروموزم شماره3 قرار دارد. ژن بتالاکتوگلوبولین در گوسفند 9737 جفت بازی و شامل 7اگزون و 6 انترون می باشد . اگزون 7 کاملا غیر فعال و 6 اگزون اول در تولید پروتیئن بتالاکتوگلوبولبن نقش دارند .
ژن بتالاکتوگلوبولین دارای دو فرم A,B می باشد که در اسیدآمینه 20 با هم تفاوت دارند آنزیمهای برش دهنده RsaI,HeaIII برای تفکیک این دو فرم بکار می رود . پروتیین بتالاکتوگلوبولین اثر مستقیم روی چربی شیر دارد - . - Bovenhuis,Weller,1994 Pirisi در سال 1998 اثر معنی دارپلی موفیسم این ژن را روی چربی شیر بیان کرد. بتالاکتوگلوبولین روی تولید شیر ومحتوی آن تاثیر دارد - . - Tsiaras et,2005و دیگر آنکه Aleandri در سال 1990وFolakiدر سال 1997 نیز اثرات معنی دار ژنوتیپ این ژن را روی محتوی چربی شیر و تولید شیر نشان دادند.هدف از این تحقیق بررسی واریانتهای A,B ×و همچنین ژنوتیپهای حاصله ژن بتالاکتوگلوبولین در نژاد گوسفند کرمانی با استفاده از مارکرهای ملکولی می باشد تا ×زمینه ای برای تعیین ارتباط این ژن با صفات تولیدی شیر در گوسفند فراهم شود.
مواد و روشها
تعداد 250 نمونه خون از گوسفند بلوچی جمع آوری گردید . برای جلوگیری از انعقاد خون به میزان 0/1هجم خون اخذ شده،محلول 0/5 - EDTA مولار با PH=8 به روش کیت - به لوله های خون افزوده گردید.استخراج DNA به روش Purification Kit که در این روش ابتدا سلولهای خون توسط یکسری مواد شیمیایی لیز شده سپس ماده رسوب دهنده را به آن می افزاییم آنگاه سانتریفوژ می کنیم رسوب را برداشته مایع روی آن را خارج می کنیم در این زمان رسوب را با شوینده های مخصوص کیت شسته و دوباره سانتریفوژ می کنیم و در مرحله آخر رسوب را در محلول حل کننده نوکلوتید حل می کنیم.
جهت تعیین کیفیت وکمیت DNA از اسپکتوفتومتر استفاده گردید.برای تکثیر ژن بتا لاکتوگلوبولین گوسفند از آغازگرهای زیر استفاده شد. برای تعیئن ژنوتیپ این ژن ،برش آنزیمی محصولات PCR با استفاده از 10 واحد آنزیم محدودگر RsaI شرکتFermentaseبه مدت 12 ساعت ساعت در دمای 37 درجه سانتیگرادصورت گرفت. محصولات هضم شده واکنش زنجیره ای پلیمراز بر روی ژل آگارز %2 به مدت 3 ساعت با ولتاژ70 الکتروفورز شده و با اتیدیوم برماید رنگ آمیزی گردید.
نتایج وبحث
استخراج DNAبا این روش مقدار بالایی از ژنوم با طولی حدود 50 الی 60 هزار جفت باز حاصل کرد که در کنار DNA لامبدا براحتی قابل ارزیابی می باشد که بعلت داشتن خلوص بالا برای کارهای مهندسی ژنتیک بسیار مناسب است .هضم محصولاتPCRبا آنزیم RsaIچند شکلی را در ناحیه مورد بررسی در گوسفند بلوچی نشان داد.که این آنزیم الل A را برش می دهد ولی بر B تاثیری ندارد.
نتیجه حاصل از این تحقیق نشان داد که ژن بتا لاکتوگلوبولین در گوسفند کرمانی دارای الل پلی مورفیسم می باشدو هر سه ژنوتیپ حاصل از دو واریانت قابل مشاهده می باشدکه در این تحقیق فراوانی A در گوسفند الل کرمانی %55و الل %45 Bبدست آمد. علاوه بر این انجام PCR-RFLP با آنزیم RasI روش مناسبی برای انتخاب ژنوتیپهای مختلف گوسفند در راستای اصلاح نژاد بر اساس ژن بتا لاکتو گلوبولین معرفی می شود ضمن آنکه آنزیم RsaI آنزیمی اختصاصی بسیار کار آمدبرای تشخیص واریانتهای این ناحیه از ژن بتالاکتوگلوبولین در نژادهای گوسفند می باشد.و نیز فراوانی ژنوتیپی به صورت زیرمی باشد.
