بخشی از مقاله
مطالعه بررسي رسوب پروتئين سيتوکروم C تحت شرايط مختلف محيطي (pH) ، توسط کالريمتري تيتراسيون هم دما، تغييرات پتانسيل زتا و ويسکومتري
چکيده
پروتئين سيتوکروم c، يک پروتئين داراي ترکيب هم است که نقش انتقال الکترون در زنجيره تنفسي سلول را در ميتوکندري دارد. تغيير شرايط محيطي پروتئين سيتوکروم c، مي تواند باعث جدا شدن ملکول هم از پروتئين شود. از طرفي، تغيير ساختار و جابجايي ملکول هم ، ممکن است منجر به رسوب و يا تشکيل پلاک هاي آميلوئيدي گردد که در بروز بيماري هايي از جمله آلزايمر و پارکينسون نقش دارند. اين مقاله به هدف مطالعه ي بررسي پايداري پروتئين سيتوکروم c، در دو حالت اسيدي (٢=pH) و خنثي (٧٤=pH) توسط آزمايشاتي نظير کالريمتري تيتراسيون هم دما، تغييرات پتانسيل زتا، تغييرات شعاع sR و ويسکومتري مورد بررسي قرار گرفته است . مجموعه اطلاعات به دست آمده حاکي از آن است که فرايند غير طبيعي شدن ساختار پروتئين سيتوکروم c و تاخوردگي مجدد آن از دو مسير کاملا متفاوت تبعيت مي کند.
کلمات کليدي: پروتئين سيتوکروم c، رسوب ، کالريمتري تيتراسيون هم دما، ويسکومتري، اندازه گيري پتانسيل زتا.
١.مقدمه
پروتئين سيتوکروم c که يک پروتئين تک زير واحد و همدارميباشد، نقش حاملها در زنجير تنفسي را ايفا ميکند پروتئين سيتوکروم c که سوبستراي آنزيم سيتوکروم c اکسيداز ميباشد يک پروتئين کوچک و محلول در آب است که با غشاي داخلي ميتوکندري پيوند سستي برقرار ميکند. پروتئين سيتوکروم cداراي محتواي مارپيچي بالايي است به طوري که داراي چهار مارپيچ آلفا بوده و فاقد صفحات تاخورده بتا است . گروه پروستتيک هم با واسطه دو پيوند تيواتر به پروتئين متصل ميشود. پيوندهاي مذکور مابين گروه هاي وينيل هم و اسيد آمينههاي سيستئين شماره ١٤ و ١٧ برقرار ميشود.
کئورديناسيون پنجم و ششم اتم آهن گروه هم با نيتروژن هيستيدين ١٨ و گوگرد متيونين ٨٠ اشغال ميشود. در هنگام تنفس اتم آهن گروه هم در پروتيئن سيتوکروم c بين حالت فرو (+Fe2) و فريک (+Fe3) متحمل اکسيداسيون و احياء ميشود. آنزيم سيتوکروم c اکسيداز عامل اصلي انتقال الکترون از سيتوکروم c به اکسيژن ميباشد. سيتوکروم c اکسيداز شامل اجزاي سيتوکروم aو a3 ميباشد. دو سيتوکروم aو a٣ انتقال الکترون را از سيتوکروم c به اکسيژن انجام ميدهند.
بدين ترتيب با قرار گرفتن سيتوکروم c احياء شده بر روي سطح غشاء ميتوکندري، الکترونها از کمپلکسIII به سيتوکروم c اکسيداز منتقل ميشوند [١].
پژوهشگران معتقدند پروتئينها به ويژه پروتئينها ي هم دار محيطهاي بسيار مناسبي براي جابجايي الکترون ها هستند. انتقال الکترون در پروتئينها از طريق تونل زدن صورت ميگيرد. به عبارتي الکترون به عنوان يک ذره در مکانيک کوانتوم از مسيرهايي در پروتئين عبور ميکند که از نظر انرژي غيرقابل دسترس است و با توجه به اينکه سد انرژي براي تونل زدن از طريق يک پيوند کمتر از سد انرژي براي تونل زدن از طريق فضا است ، انتقال الکترون عمدتا از طريق پيوندها صورت ميگيرد [ ٣ ،٢]. از اينرو سرعت انتقال الکترون علاوه بر فاصله بين مراکز اکسيد و احياء، به نوع پروتئين و ماهيت پيوندهاي موجود در يک مسير نيز بستگي دارد. براساس پيشبينيهاي نظري و شواهد حاصل از تجربه ، انتقال الکترون از طريق صفحات بتا سريع تر از مارپيچها ي آلفا صورت ميگيرد که اين موضوع به ماهيت پيوندها ي هيدروژني در صفحات تاخورده بتا و نظم ساختاري در آنها نسبت به مارپيچ آلفا ميباشد [٤].
سيتوکروم c هموپروتئين تک زيرواحد است که داراي ١٠٤ اسيد آمينه بوده و وزن مولکولي آن ١٢٠٠٠ دالتون ميباشد. اين پروتئين شکل مارپيچي داشته و داراي ٥ مارپيچ آلفا است و ٦٥.٣٣ درصد ساختار اين پروتئين مارپيچ آلفا ميباشد. سهم عمدة اسيدهاي آمينه در اين پروتئين از نوع اسيدهاي آمينه قطبي بوده از اين رو اين پروتئين جزء پروتئين هاي قطبي محسوب ميشود [ ٥]. گروه پروستتيک هم در سيتوکروم c در يک ناحيۀ آبگريز قرار گرفته ، بنابراين به گروههاي اسيدهاي آمينه آبگريز متصل ميباشد. جابجايي هم در اين پروتئين سبب کاهش انتقال الکترون و تغيير در عملکرد پروتئين خواهد شد. از آنجائيکه گروه هم در ناحيه آبگريز پروتئين قرار دارد عامل اصلي در انتقال الکترون را مي توان به نيروهاي آبگريز نسبت داد. در پروتئين سيتوکروم c به دليل جايگاه قرارگيري گروه هم که در برهم کنش با مارپيچهاي آلفاي اطراف آن است فرايند انتقال الکترون و اکسيداسيون و احياي مربوط به اين پروتئين را تسهيل ميکند.
قرارگيري پروتئين در محيطهاي مختلف ميتواند کئورديناسيون آن را تغيير دهد که در نتيجه تبديل آهن فرو به فريک و يا بالعکس ميباشد که نتيجه آن تغيير در فرايند اتقال الکترون است . محيطهاي غير قطبي و قطبي ميتواند اين فرايند را سبب شود.
تجمعات پروتئيني، گردهمايي مونومرهاي تانخورده يا غير طبيعي جهت تشکيل اوليگومرهايي با ساختار منظم يا نامنظم و تجمعات با وزن ملکولي بالا مي باشند. مطالعه تجمع ات غير طبيعي پروتئين ها در سالهاي اخيرمورد توجه محققين در حوزه هاي مختلف علوم به ويژه پزشکي و بيوتکنولوژي قرار گرفته است . در حوزه پزشکي مطالعات عمدتا در رابطه با بيماري هايي است که ارتباط مستقيمي با اختلالات ساختاري پروتئين ها دارند. تاکنون بيش از بيست نوع بيماري در انسان شناسايي شده است که با تشکيل تجمعات پروتئيني معروف به آميلوئيد همراه هستند.از بيماري هاي مهم آميلوئيدوزيز مي توان به بيماري هاي تحليل برنده سيستم اعصاب مرکزي مانند آلزايمر و پارکينسون وآميلوئيدوزيزهاي سيستميک مانند ديابت نوع دو اشاره کرد[٨-٦].
٢.هدف
هدف اصلي در اين مطالعه ، اين است که بتوانيم پس از شناخت عوامل ايجاد رسوب ، با حذف اين عوامل ، شرايط محيطي پروتئين سيتوکروم c را طوري فراهم نماييم تا اينکه پروتئين دوباره به حالت طبيعي خود بازگشته و ملکول هم دوباره در داخل پروتئين سيتوکروم c قرار گيرد.
حال با توجه به اينکه پروتئين سيتوکروم c به عنوان يک پروتئين الگو در مطالعات ساختاري پروتئين استفاده مي تعميم نتايج حاصل از اين مطالعه ، راهکاري مفيد براي بيماري هاي وابسته به پروتئين ، که در اثررسوب شود، مي توانيم با پروتئين ها ايجاد ميشود، ارائه نماييم . در واقع نتايج اين مطالعات ميتواند مسيرهاي جالب توجهي را براي آينده در ارتباط با بيماريهاي مربوط به رسوب ، در فرايند تجمع پروتئين ها باز کند.
٣.تاريخچه و سوابق مربوطه
در سال هاي اخير، بسياري از اين بيماري ها جزو معضلات بزرگ در بخش درماني محسوب مي شوند. به گزارش سازمان جهاني بهداشت بيماري هاي تحليل برنده مغزي با منشاء آميلوئيدي يکي از بزرگ ترين مشکلات قرن ٢١ خواهد بود و پيش بيني مي شود افراد بالاي ٦٠ سال مبتلا به اين اختلالات تا سال ٢٠٥٠ ميلادي به ميزان سه برابر افزايش يابند[٩].
امروزه بيش از ١٠ در صد افراد بيش از ٧٠ سال و يک سوم افراد بالاي ٨٥ سال ، مبتلا به بيماري هاي تحليل برنده سيستم اعصاب مرکزي مي شوند، که تقريبا نيمي از آنها مبتلا به آلزايمر هستند. پارکينسون دومين بيماري رايج بعد از آلزايمر در افراد مسن مي باشد و بيش از ٢.٦ درصد افراد بالاي ٨٥ سال به آن مبتلا هستند[١٠].
٤.مواد وروشها
وسايل ودستگاههايي که دراين تحقيق استفاده شده اندبه شرح زيرمي باشند:
١) دستگاه اندازه گيري پتانسيل زتا (Malvern Instruments Ltd,Uk( Nanoseries-zs
٢) دستگاه کالريمتري تيتراسيون همدما
٣)ويسکومتر استوالد
٤) pH متر و ترازوي ديجيتال با دقت ٥-١٠ گرم
٥) سمپلروسرسمپلر با حجم هاي متفاوت
موادي که دراين تحقيق مورداستفاده قرارگرفته اندشامل مواردزيرمي باشند:
١) پروتئين سيتوکروم c قلب اسب با جرم مولکول ي١٢٣٨٤ گرم بر مول (دالتون ) خريداري شده از سيگماي آمريکا(St. Louis, MO, USA)Sigma-Aldrich
٢) اسيد کلريدريک ٠.٥ مولار
٣) هيدروکسيد سديم ١ مولار
٤) اسيد کلريدريک ٢٠ ميلي مولار (بافر اسيدي )
روشها پتانسيل زتا
پتانسيل زتا يک مفهوم علمي است که براي پتانسيل الکترو س ينيتيک در سيستمهاي کلوئيدي استفاده ميشود. به کمک پتانسيل زتا ميتوان به ماهيت و نوع نيروهاي دخيل در شکل گيري پيوند بين پروتئين و ليگاند پي برد. از نقطه نظر تئوري، پتانسيل زتا، توزيع پتانسيل الکتريکي است که در فصل مشترک (با جدايش فازي) فاز جامد محلول هاي الکتروليت وجود دارد، اين توزيع
