بخشی از مقاله
چکیده:
حیوان ترانس ژنیک در مقایسه با روش هاي سنتی منبع بالقوه اقتصادي براي تولید پروتئین هاي درمانی می باشد. اولین مرغ ترانس ژنیک با استفاده از رتروویروس هاي پرندگان و با تزریق ویروس نزدیک جنین بلاستودرمال در تخم مرغ انجام شد. سري جدیدي از وآتورهای ویروسی داراي ایمنی زیستی به محققین معرفی که فاقد قدرت تکثیر بوده و قادر به انتقال ژن می باشند. ویروس های پانتروپیک هم سلولهاي پستانداران و هم سلولهاي غیرپستانداران را می تواند آلوده نمایند و با پسودوتایپ کردن ویریون با گلیکوپروتئین پوشش ویروس وزیکولار استوماتیس از طریق چربی به غشاء پلاسمایی متصل و داخل می شود و بدین ترتیب ویروس تولید شده سلولها را آلوده و انتقال ژن مورد نظر را موجب می شودو برای ردیابی ژن در سیستم جاندار ژن مورد نظر با ژن گزارشگر GFP فیوز می گردد.
خاصیت اتصال اختصاصی آنتی بادي ها به مولکولهاي هدف آنها را به یکی از گسترده ترین عوامل تشخیصی و درمانی علیه طیف وسیعی از بیماریهاي عفونی و ژنتیکی از جمله سرطان تبدیل کرده است و با توجه به نیاز گسترده انتقال و تولید آن در حیوان راهگشا می باشد . سیگنال ترشحی لیزوزیم که حاوی اسیدآمینه هیدروفوب و اسید آمینه های دارای بار مثبت به ترشح پروتین از سلول کمک می نماید. قطعه حاوی آنتی بادی تک دومنی شتری فیوز شده به ژن گزارشگرGFP به اضافه سیگنال ترشحی لیزوزیم در وکتوررتروویروسی کلون و با ترانسفکشن همزمان باوکتور بیان کننده گلیکوپروتئین ویروس وزیکولار استوماتیت ذرات ویروس حاوی این ژن به منظور تزریق به سلولها جنینی مرغ بدست آمد.
مقدمه:
امروزه براي تولید محصولات نوترکیب دارویی، حیوان ترانس ژنیک مد نظر دانشمندان می باشد به طوري که امروزه بیش از 60 پروتئین بیوفارماکولوژیک حیوانات تولید می شود. از طرفی به دلیل اینکه سیستم فسفریلاسیون و گلیکوزیلاسیون مرغ مثل انسان می باشد، تخم مرغ به عنوان بهترین راکتور توجه دانشمندان را جلب نموده است. بدین دلیل از اواخر 1980 برنامه مرغ ترانس ژنیک در دستور کار محققین قرار گرفت. ایجاد مرغ ترانس ژنیک با تزریق به تخم، استفاده از سلولES برای تولید آایمر، انتقال سلولهاي primordial germ cell و استفاده از وآتورهاي ویروسی امکان پذیر می باشد 1 - و2و. - 3 امروزه تکنولوژي انتقال ژن با ویروس های فاقد قدرت تکثیربرای تولید حیوان ترانس ژنیک به کار می رود - 4و. - 5 جدا آردن ورود و اینتگره شدن ژنهاي ساختمانی شانس تولید ویروسهاي تکثیري را به علت ریکامبیناسیون طی تکثیر ویروس را آاهش می دهد.
ترانسفکت وآتور رتروویروس به سلولهاي بسته بندي آننده می تواند ویروسهاي با تیتر بالا و فاقد قدرت تکثیر تولید نمایند. ژن env ویروس، بوسیله رده سلولی بسته بندي آننده بیان می شود آه دامنه عفونت زایی - - Tropism را مشخص می نماید و طبق رسیتورهایی آه envelope ویروس براي ورود به سلولهاي میزبان استفاده می شود دسته بندي می شوند. رده سلولی pantropic مزیتی دارد آه هم سلولهاي پستانداران و هم سلولهاي غیرپستانداران را می تواند آلوده نمایدو با استفاده از رده سلولی ویریونها با گلیکوپروتئین پوشش ویروس - Versicular Stomatitis Virus - VSV-G پسودوتایپ شده که VSV- G از طریق اتصال و فیوژن با غشاء پلاسمایی داخل می شود. با ترانسفکشن همزمان وآتور بیانی رتروویروس و pVSVG به رده سلولی ویروس تولید می شود. ویروس تولید شده را براي آلوده نمودن سلولها و انتقال ژن مورد نظر استفاده نمود.
مواد و روشها
برای اینکه ردیابی ژن در سیستم جاندار براحتی امکان پذیر باشد، فیوژن حاصل از آنتی بادي تک دومنی شتری با ژن گزارشگر GFP و سیگنال ترشحی لیزوزیم تهیه گردید. با استفاده ازپرایمرهاي IgF1 و IgRev قطعه VHH تکثیرشد. توالی سیگنال لیزوزیم مرغ بعنوان سیگنال ترشحی به طول 60bp انتخاب و به ژن VHH توسط واکنش - SOE – PCR - Splice by Overlapping Extension -PCR متصل و با پرایمرهای Ig-F3 و IgRev - دارای محل برش آنزیمهاي BamHI و - Hind III این مجموعه تکثیر شد. با استفاده از پرایمرهاي GFP-F و GFP-REV دارای محل هاي برش آنزیمی BglII و HindIII واآنش زنجیره اي پلیمراز بر روي وآتور GFP-C1 انجام شدو قطعه ژنی کلون گردید. در این تحقیق آلونینگ فیوژن signal-ly-VHH- GFP ابتدا در وآتور AAV صورت گرفت و قطعه حاوی آنتی بادی تک دومنی شتری فیوز شده به ژن گزارشگر GFP به اضافه سیگنال ترشحی لیزوزیم به طول 1180 جهت آلونینگ در وکتور رتروویروسیpLNHX از وکتور ویروسی-AAV-MCS signal-ly-VHH- GFP به دست آمد.
وآتور pLNHX با آنزیم BglII تحت هضم آنزیمی قرار گرفته و پس از تخلیص از ژل آنزیم آلکالن فسفاتاز اضافه گردید. قطعه از وآتور AAV-MCS-ly-VHH-GFP توسط دو آنزیم BamHI و BglII بدست و تخلیص شد. واآنش لیگاسیون با نسبت مولی 5 به 1 صورت گرفته و پس از ترانسفورماسیون و انجام آلونی PCR تعدادي از آلنی هاي مثبت جهت تأیید قرار گرفتن ژن انتخاب گردیدند. هضم آنزیمی بر روی پلاسمیدهای تخلیص شده از آلنی هاي مثبت انجام شد. وآتور نوترآیب - N31 - N31 pLNHX31 حاوي ژن مورد نظر با BglII و ClaI هضم آنزیمی و اگر از وآتور نوترآیب جدید هیچ قطعه اي خارج نشود ژن به صورت درست قرار گرفته است. به منظور بدست آوردن ذرات رتروویروس ترانسفکشن همزمان سلول هاي GP-293 با - N31 - pLNHX31 و pSVG با استفاده از لیپوفکتامین 2000 در پلیت هاي کشت سلول انجام شد. سلولها 48 ساعت بعدمشاهده شدند. تغییر شکل سلولی مؤید ساخت ویروس توسط این سلولها می باشد. الایزا بر روي تغلیظ شده ویروس با استفاده از آنتی بادي علیه P24 جهت تأیید ساخت ذرات ویروس انجام شد.
نتایج:
تکثیر ژن - VHH آنتی بادی تک دومنی شتری - باند در 400 مشاهده شد - - A .آنتی بادی تک دومنی شتری به اضافه سیگنال ترشحی لیزوزیم باند در 460 شد . - B - تکثیر ژن . - C - GFP هضم آنزیمی وکتورAAV-MCS-Signal Ly-VHH-GFP جهت بدست آوردن قطعه 1180 حاوی آنتی بادی تک دومنی شتری فیوز شده به ژن گزارشگر GFP به اضافه سیگنال ترشحی لیزوزیم - D - هضم آنزیمی وکتور رتروویروسی. - E - pLNHX شدن قطعه 1180 دال بر سر و ته قرار گرفتن ژن می باشد و وکتورستون شماره 4 به دلیل خارج نشدن قطعه دارای ژن بصورت درست می باشد - . - G سلول کنترل . - H - GP -293 سلولهای ترانسفکت شده همزمان با pLNHX 31 و pSVG و مشاهده تغییرات سلولی . - I - نتایج الایزا با آنتی بادی علیه . - J - P24
بحث:
انتقال ژن با استفاده از روشهایی مثل میکرواینجکشن فاقد کارآیی لازم و پرهزینه می باشد اما انتقال ژن با ناقلین بیولوژیک به میزان بالا و با کاهش هزینه ها امکان پذیر می باشد. امروزه ا نتفال ژن با استفاده از وکتورهای پسودوتایپ شده با گلیکوپروتئین پوشش ویروس وزیکولار استوماتیس در بسیاری ازگونه ها انجام شده است. ژن لیزوزیم مرغ حاوی سیگنال پپتیدی است که موجب ترشح آن می گردد و از این سیگنال برای تسهیل ترشح تعداد زیادی از پروتئین ها استفاده می شود 6 - و. - 7در این تحقیق ذرات رتروویروسی دارای سیگنال ترشحی لیزوزیم –آنتی بادی تک دومنی شتری فیوز شده به ژن گزارشگر که دارای پوشش گلیکوپروتئین ویروس وزیکولار استوماتیس می باشد به منظور انتقال به ساولهای ژرمینال مرغ تهیه و انتخاب ژن گزارشگر جهت invivo fluorescence imaging میباشد.
