بخشی از مقاله
چکیده:
هدف از این تحقیق اتصال یک پلی ساکارید عملگر، بتاگلوکان، به لیزوزیم به منظور بهبود خواص ضد میکروبی آن است. گلیکوزیله کردن لیزوزیم با بتاگلوکان از طریق واکنش میلارد - دماي 60º C و رطوبت نسبی %79 به مدت یک هفته - و با نسبت وزنی 1 به 1 صورت گرفت. نتایج حاصل از الکتروفورز SDS-PAGE و کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون G-100 اتصال لیزوزیم به بتاگلوکان را تایید کرد و نشان داد که به هر مول لیزوزیم 3/6 میلی مول بتاگلوکان اتصال یافته است. فعالیت آنزیمی لیزوزیم در اثر کنژوگه کردن به میزان % 55/ 6 کاهش یافته است. نتایج حاصل از آزمایشات میکروبی نیز حاکی از آن بودند که کنژوگه کردن لیزوزیم با بتاگلوکان موجب بهبود اثر ضدمیکروبی لیزوزیم در برابر باکتري گرم منفی E.coli می شود، در عین حال اثر ضد میکروبی آن بر روي باکتري گرم مثبت S.aureus محفوظ می ماند. استفاده از آنزیم گلیکوزیله شده با بتاگلوکان در غلظت 400 میکروگرم بر میلی لیتر جمعیت باکتري S.aureus را به میزان 3/24 و باکتري E.coli را به مقدار 3/03 سیکل لگاریتمی کاهش می دهد. نتایج حاصل از این تحقیق نشان می دهد کنژوگه بتاگلوکان- لیزوزیم می تواند به عنوان یک ترکیب ضد میکروبی مناسب در صنایع غذایی و دارویی بکار رود.
مقدمه:
لیزوزیم یک پروتئین ضد میکروبی طبیعی است که بدلیل پایداري زیاد در شرایط مختلف کاربردهاي زیادي را در صنایع غذایی، دارویی، پزشکی و آرایشی دارد - 7و17و. - 20 با این وجود محدود بودن فعالیت ضد میکروبی آن به باکتري هاي گرم مثبت موجب گردیده که کاربرد لیزوزیم به عنوان یک نگهدارنده طبیعی در غذا چندان توسعه اي نیابد - . - 8لیزوزیم لایه پپتیدوگلیکان دیواره سلولی باکتري ها را هیدرولیز می کند. این در حالی است که باکتري هاي گرم منفی غالبا به عنوان عوامل فسادزا و میکروارگانیزم هاي بیماري زاي حاصل از غذا4 محسوب می شوند. این باکتري ها بر روي لایه پپتیدوگلیکان داراي غشاي خارجی هستند که به عنوان مانعی در برابر عمل آنزیم محسوب می شود - 8و. - 13 روش هاي متعددي براي غلبه بر این مشکل بکار رفته است که از آن جمله می توان به گلیکوزیله کردن - یا اتصال کوالانسی لیزوزیم به یک پلی ساکارید - لیزوزیم اشاره کرد. انجام این عمل علاوه بر افزایش اثر ضدمیکروبی لیزوزیم موجب بهبود خواص عملکردي آن می شود - 11و. - 12 کنژوگه پروتئین-پلی ساکارید تهیه شده به روش میلارد با حرارت دهی در شرایط خشک مخلوط پروتئین-پلی ساکارید در شرایط کنترل شده دما، رطوبت و pH ایجاد می شود که به عنوان یک ترکیب بیوپلیمري جدید داراي خواص عملکردي بهتر و اثرات ضد میکروبی است گزارش شده که کنژوگه کردن لیزوزیم با دکستران به روش میلارد موجب افزایش خاصیت آبگریزي5 آنزیم و در نتیجه عملکرد بهتر آن در مقابل باکتري هاي گرم منفی در مقایسه با آنزیم اصلاح نشده می شود. بعلاوه خواص امولسیفایري و پایداري حرارتی آنزیم نیز طی اتصال به دکستران افزایش می یافت. بعضی محققین همین مساله را دلیل افزایش خاصیت ضد میکروبی آنزیم مطرح کردند - . - 11 بتاگلوکان یک پلی ساکارید ساختاري متشکل از واحدهاي گلوکزي اتصال یافته β - 1→4 - و β - 1→3 - است که در دیواره سلولی غلات - بویژه جو و جودوسر - یافت می شود - . - 2 این ترکیب به عنوان یک جزء غذایی عملگر6 محسوب شده و با کاهش میزان کلسترول و شاخص گلایسمیک خطر ابتلا به بیماري هاي قلبی-عروقی و دیابت را کاهش می دهد - . - 5 بعلاوه می تواند به عنوان یک قوام دهنده، پایدارکننده کف و امولسیفایر در مواد غذایی استفاده شود - 4،3و. - 19 همچنین گلوکانها به عنوان محرك پاسخ هاي بیولوژیک - سیستم ایمنی - در تمام گونههاي حیوانات - از کرم خاکی تا انسان - محسوب می شوند که همین مساله دلیل افزایش علاقه در زمینه مطالعه این ترکیبات می باشد - . - 18 هدف از مطالعه حاضر اتصال کووالانسی بتاگلوکان به لیزوزیم از طریق واکنش میلارد و بررسی خواص ضدمیکروبی آن می باشد.
مواد و روش ها:
- مواد:
لیزوزیم سفیدة تخم مرغ - با وزن مولکولی 14600 دالتون - از شرکت Anovatech کانادا و بتاگلوکان خالص با وزن مولکولی 160000 دالتون از شرکت Megazyme ایرلند تهیه شدند. سفادکس G-100 جهت انجام کروماتوگرافی از شرکت Sigma خریداري گردید. بقیه مواد نیز از شرکت هاي تجاري تهیه گردیدند.
- آماده سازي نمونه:
یکصد میلیگرم بتاگلوکان و صد میلیگرم لیزوزیم در 3 میلی لیتر آب مقطر حل شده و سپس لیوفیلیزه گردید. پودر حاصل در دماي °c به مدت یک هفته در حضور محلول آبی برومید پتاسیم فوق اشباع به منظور تأمین رطوبت نسبی %79 قرار داده شد - لیزوزیم کنژوگه - . یک نمونه لیزوزیم بدون بتاگلوکان نیز به عنوان نمونه شاهد تحت همین شرایط قرار گرفت - لیزوزیم حرارت دیده - . به منظور جداسازي لیزوزیم گلیکوزیله شده از نمونه اصلاح نشده از کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون با سفادکس 80× 1/5 - G100 سانتیمتر - استفاده گردید. براي این منظور 200 میلیگرم از پودر خام در 3 میلی لیتر بافر فسفات سدیم 0/05 مولار با pH برابر 7/4 حل شده و سپس به مدت 10 دقیقه در دور 3500 rpm سانتریفیوژ شد. مایع رویی از رسوب جدا شده و بر روي ستون کروماتوگرافی قرار داده شد. این ستون به ظرف محتوي بافر فسفات متصل گردید و نمونه ها هر کدام بصورت جداگانه جمع آوري و براي انجام مطالعات بعدي در یخچال نگهداري شدند.
- الکتروفورز:
به منظور سنجش میزان اتصال بتاگلوکان به آنزیم لیزوزیم الکتروفورز SDS-PAGE در یک سیستم بافري ناپیوسته - با استفاده از ژل پلی اکریل آمید با شیب غلظت - 5– 20% - انجام شد.
- بررسی میزان گلیکوزیله شدن:
کل میزان قند نمونه با روش فنل سولفوریک اسید و استفاده از خود بتاگلوکان به عنوان استاندارد بدست می آید. تعداد مول هاي بتاگلوکان اتصال یافته به یک مول پروتئین، با در نظر گرفتن وزن مولکولی بتاگلوکان - - 160000 و لیزوزیم - - 14600 بدست آمد - . - 6
- فعالیت آنزیمی:
فعالیت آنزیمی لیزوزیم با بررسی تغییرات کدورت یک محلول سوسپانسیون سوبستراي لیزوزیم - میکروکوکوس لیزودیکتیکوس - تعیین می شود و بنا به تعریف یک واحد فعالیت برابر با کاهش جذب 0/001 در دقیقه، در طول موج 450nm ، pH برابر 7 و دماي °c است - . - 9
- بررسی اثر ضدمیکروبی:
باکتري هاي اشریشیاکلی و استافیلوکوکوس اورئوس در محیط Nutrient broth براي مدت زمان 15 ساعت در 37°C کشت داده شدند. سپس جذب نوري نمونه ها در طول موج 675 خوانده شد و بر این اساس تعداد باکتري ها برآورد گردید. بعد از انجام رقیق سازي دسیمال و رساندن جمعیت باکتري ها به 105، مقدار مورد نظر از لیزوزیم اصلاح نشده و کنژوگه شده با بتاگلوکان به سوسپانسیون هاي سلولی اضافه شدند تا غلظت نهایی لیزوزیم به % ./05 برسد. براي این منظور 4/5 میلی لیتر از محیط Nutrient broth - حاوي جمعیت - 105 به 0/5 میلی لیتر بافر فسفات سدیم 10 میلی مولار با pH برابر 7 که حاوي رقت هاي 400 و 800 میکروگرم در میلی لیتر آنزیم - اصلاح شده، اصلاح نشده - بود اضافه گردید. یک نمونه فاقد آنزیم نیز به عنوان کنترل در نظر گرفته شد. نمونه ها به مدت 5 ساعت در 37°C گرمخانه گذاري شدند. سپس یک میلی لیتر از هرکدام بطور جداگانه برداشته شد و بعد از انجام رقیق سازي دسیمال در محیط آب نمک سترون، بر روي محیط Plate count agar کشت داده شد. شمارش کل میکروبی بعد از 24 ساعت گرمخانه گذاري در 37° C صورت گرفت.
- آنالیز آماري:
کلیه آزمایشات در این تحقیق در 3 تکرار انجام شد و ارزیابی آماري آنها با استفاده از برنامه نرم افزاري SPSSصورت گرفت.
