بخشی از مقاله
چکیده
روش واکنش زنجیرهای پلیمراز- تفاوت طول قطعات حاصل از هضم - PCR-RFLP - برای اولین بار در ایران برای ارزیابی و مشخص نمودن روابط هاپلوتایپی و ساختار جمعیتی در 14 نمونه چای از سه کشور ایران، هند - آسام - و ژاپن بکار رفت. سه آغازگر عمومی کلروپلاست HK - ، DT و - B1B2 و یک آنزیم برشی - AluI - در این بررسی استفاده شدند و از ژل آگارز برای تفکیک باندها استفاده شد.
آغازگر B1B2 به علت تولید چندین باند در این بررسی قابل بهره برداری نبود. همچنین آغازگر DT پس از برش حالت یک شکلی تولید کرد و فقط برش قطعات حاصل از پرایمر HK حالت چند شکلی نشان داد. جهشهای مشخص شده توسط ترکیب پرایمر- آنزیم برشی HK-AluI جهشهای حذف- اضافه بودند که نمونهها را در پنج هاپلوتایپ H1 - ، H2، H3، H4 و - H5 گروهبندی نمودند. توزیع نمونهها در گروه های هاپلوتایپی با توزیع جغرافیایی همخوانی نداشت و هیچ هاپلوتایپی خاص یک سری نمونه نبود. با توجه به نتایج میتوان بیان کرد که روش PCR-RFLP روشی مناسب برای بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای چای در سطح اندامکی میباشد.
مقدمه
در دودهه گذشته، کاربرد تکنیکهای جدید مولکولی در مطالعات بیولوژی در سطح وسیعی افزایش یافت که از این بین نشانگرهای مولکولی ژنتیکی نقش بزرگی در دادن سر نخ در شرح و توصیف تکامل جمعیتها و ساختار جمعیتی بازی کردهاند که استفاده از آنها همچنان در حال افزایش میباشد. متخصصین ژنتیک جمعیت معمولا ازنشانگرهای سیتوپلاسمی برای برآورد خویشاوندی نسبی داخل و میان جمعیتها استفاده میکنند و تعیین نحوه انتقال - وراثت - ژنوم اندامک که یک عامل مهم تعیین سطح ساختار جغرافیایی در گیاهان است از نکات حائز اهمیت قبل از هرگونه تلاش در مورد مطالعات مشابه میباشد
ژنوم اندامکها - سیتوپلاسمی - منبع قابل توجهی از نشانگرهای مولکولی میباشند. برای مثال، از این نشانگرهای سیتوپلاسمی به طور گستردهای در چند سال گذشته برای درک واکاوی مسیرهای مهاجرت پس از عصر یخبندان برای طیف وسیعی از موجودات زنده از جمله درختان استفاده شده است
بااینحال مشخص شده است که DNA میتوکندریایی گیاهان دارای سرعت جانشینی نوکلئوتیدی پایینتری از DNA کلروپلاستی میباشد - Palmer, 1992 - ، بنابراین ترجیحا در گیاهان از DNA کلروپلاستی - بطور عمده برای گونههای دارای وراثت مادری - برای این گونه مطالعات استفاده میشود
نشانگرهای سیتوپلاسمی - عمدتا DNA کلروپلاستی - دربسیاری از مطالعات تکامل نژادی مورد استفاده قرار گرفته است . - Samuel et al., 2005 - به دلیل توالی DNA در دسترس و همچنین به خاطر حفاظت شدگی ژنها در ژنوم کلروپلاستی، طراحی آغازگرهای متعدد عمومی تسهیل گردیده است که این موضوع به شدت مطالعات جمعیت و تکامل نژادی را ترویج و تشویق نموده است. از این آغازگرها برای تشخیص تنوع ژنتیکی، نحوه توارث، بررسیهای فیلوژنی - Grivet et - al., 2001، رابطه جغرافیایی و مسیرهای تکامل گونهها بعد ازعصر یخبندان - Hamza, 2005 - ، در شناسایی دورگهها در ترکیب با نشانگر DNA هستهای - Heinze, - 1998 و برای مطالعه گونههای نزدیک مرتبط - Hamza - et al ., 2009 مورد استفاده قرار گرفتهاند.
مطالعات زیادی با کار برد نشانگرهای مولکولی DNA کلروپلاستی صورت گرفته است Cross et al., 1998 - ، Panda et al., 2003، Tanikawa et al., 2008، Golein et al., 2012، Chen et al., 2012، Chen et al., 2012، Khiavi et al., 2013 و Khadivi -khub et al., . - 2014که با توجه به اینکه نمونهها یا آغازگرهای متفاوت در بررسیها بکار برده شده است محدودیت امکان مقایسه وجود دارد. اما با این وجود مشاهده میگردد که تعداد هاپلوتایپها در بررسیهای مشابه نیز محدود و کم میباشد.
این تحقیق به منظور بررسی سودمندی تجزیه و تحلیل جایگاههای برش DNA کلروپلاستی تکثیر شده توسط واکنش PCR برای اندازه گیری سطح جداسازی و قدرت تفکیک این مولکول DNA در ژنوتیپهای چای صورت گرفته است تا از این راه کمکی به مدیریت و برنامه ریزی جهت حفاظت از ژرم پلاسمهای ارزشمند چای ایران باشد.
مواد و روشها
برگهای جوان کامل شده 14 نمونه چای شامل 10 ژنوتیپ ایرانی، سه کلون تجاری وارداتی از ژاپن و یک رقم آسامی به عنوان نمونههای بین المللی جمع آوری شدند - جدول - 1 و استخراج DNA ژنومی از نمونههای برگی به روش دلاپورتا و همکاران با اندکی تغییر صورت گرفت.
جدول -1 اسامی نمونههای چای مورد بررسی، محل نمونهگیری و گروههای هاپلوتایپی مشخص شده در این پژوهش
جهت تکثیر از روی DNA استخراج شده سه جفت آغازگر واسرشسته سازی در 94 درجه سانتی گراد به مدت 1
عمومی کلروپلاست HK - ، B1B2، Grivet et al. - - DT دقیقه، دمای اتصال برای آغازگرها و مدت زمات آن بر
- 2001 بکار رفتند. جدول 2 نسبت و مواد بکار رفته در اساس جدول 3 به مدت 1 دقیقه و توسعه در 72 درجه
واکنش PCR را نشان می دهد. شرایط دمایی نیز به این سانتی گراد به براساس جدول 3 از لحاظ زمان بندی و در
صورت تنظیم گشت که در ابتدا واسرشسته سازی اولیه در نهایت در دمای 72 درجه سانتی گراد به مدت 7 دقیقه
94 سانتی گراد به مدت 3 دقیقه، 35 چرخه شامل توسعه نهایی انجام شد.
جدول -2 نوع مواد تشکیل دهنده اجزای PCR و مقدار پیشنهادی برای نشانگرهای ISSR درحجم نهایی25 میکرولیتر
هضم و برش قطعات تکثیر شده در واکنش زنجیرهای پلیمراز توسط آنزیم محدودگر AluI بر اساس دستور العمل شرکت تولید کننده و به مدت 8 ساعت انجام پذیرفت. جهت بررسی چند شکلی قطعات حاصل از هضم الکتروفورز در ژل آگارز %3 صورت گرفت و جهت رنگ آمیزی از ماده safe stain استفاده شد
