بخشی از مقاله
چکیده
استفاده از گیاهان به عنوان دارو پیشینهی بسیار قدیمی دارد و در تمام تمدنهای گذشته از آنها به عنوان داروهای گیاهی استفاده میکردند. بارهنگ یکی از جنسهای خانواده پلانتاجیناسه و گیاهی دارویی است. بارهنگ کبیر - Plantago major - یکی از با ارزش-ترین گونههای این جنس است و متابولیتهای ثانویه باارزشی دارد. ریزنمونههای برگ، ساقه و ریشه این گیاه در شرایط درون شیشه-ای بر روی محیط - MS - با ترکیب غلظتهای مختلفی از تنظیم کنندههای رشدی TDZ و IBA کشت گردیدند.
بعد از چهار هفته، درصد کالوس زایی و باززایی ریزنمونهها محاسبه شدند. بیشترین درصد کالوسزایی - %100 - در سطح 2:1 میلیگرم بر لیتر TDZ: IBA در هر سه ریزنمونه و بیشترین باززایی - - %100 در برگها و در ترکیبات هورمونی 1:0/5 میلیگرم بر لیتر TDZ: IBA ، 1 1/5:میلیگرم بر لیتر TDZ: IBA بترتیب با درصد باززایی مستقیم %30 - و - % 69/05 و 1/5: 2 میلیگرم بر لیتر TDZ: IBA ، 2:1 میلیگرم برلیتر TDZ: IBA با درصد باززایی غیر مستقیم - %83/33 و - %100 نشان داده شد.
غلظت 2:1 میلیگرم بر لیتر TDZ: IBA توانست بیشترین درصد باززایی و کالوس را در هر سه ریزنمونه نشان دهد و بالاترین فراوانی در تعداد شاخه در محیط حاوی 1:2 میلیگرم بر لیترTDZ: IBA - برگ - 41/67 و 2:2 میلیگرم بر لیتر TDZ: IBA - ساقه - 21 و - ریشه - 9 مشاهده گردید.
گیاهچه-های باززا شده برای ریشه زایی به محیط 0/5 میلی گرم بر لیتر IBA انتقال یافتند و گیاهچههای ریشه دارشده به گلدانهای حاوی پیت ماس و پرلیت - %80:20 - منتقل شدند و در فواصل منظم با محلول هوگلند و آب مقطر آبیاری گردیدند. نتایج ما نشان داد که باززاییها از نوع شاخههای جانبی - - Adventitious shoot هستند و گیاه بارهنگ کبیر پتانسیل بالایی برای باززایی دارد و ریزنمونه برگ این گیاه در مقایسه با ریزنمونه های دیگر باززایی بهتری را نشان دادند.
مقدمه
گیاهان گروه بزرگ و متنوعی از ترکیبات آلی به نام متابولیتهای ثانویه را تولید میکنند که توسط انسان به عنوان ترکیب دارویی مصرف میشوند - Oksman-.Caldentey and Inzé, 2004 - بزرگترین جنس از خانواده بارهنگ، پلانتاجیناسه - Plantaginaceae - ،جنس است و شامل حدود 275 گونه می-باشد
بارهنگ کبیر - P. major - L.، جزء گستردهترین گونههای گزارش شده در مقالات میباشد . - Fons et al., 2008 - گونه بارهنگ کبیر - P. - major گیاهی با توزیع جغرافیایی وسیع در چمنزارهای معتدل جهان است و در مناطق وسیعی از اروپا و مناطق معتدلی از آسیا، جنوب استرالیا و همچنین شمال آفریقا و آمریکا رشد میکند
این گیاه از جمله گیاهان دارویی ارزشمند است که در سالهای اخیر مورد توجه زیادی قرار گرفته است و حدود 483 گونه از جنس Plantago در سراسر دنیا توزیع شده است
بارهنگ دارای خواص دارویی متعددی است، به عنوان مثال برگها و بذرهای این گیاه دارای موسیلاژ میباشند که از این مواد برای فرمولاسیون تعدادی از داروهای خاص استفاده میشود
با توجه به مواد فیتوشیمیایی موجود در برگ، ریشه و دانههای P.major، این گونه دارای ویژگیهای درمانی از جمله ضدزخم، ضد التهاب، ایمن سازی، آنتیاکسیدان، ضدویروس، ضدمیکروب، ضدسرطان و التیام دهنده جراحات میباشد
برخی از محققان گزارش کردند که P. major حاوی ترکیبات فعال بیولوژیکی مانند آلکالوئیدها، پلیساکاریدها، لیپیدها، مشتقات اسیدکافئیک، فلاونوئیدها، گلیکوزیدهای ایریدوئید، ترپنوئیدها، اسیدهای چرب و برخی از مشتقات ساختاری آنهاست
ترکیبات فلاونوئیدی یکی از مشخصترین کلاسهای ترکیبات در plantago است - Kawashty et .al.,1994 - یکی از روشهایی که امروزه بیش از هر موضوع دیگر در زمینه بررسی متابولیتهای گیاهی مورد توجه قرار دارد، روش کشت اندام، بافت و سلول-گیاهی است
هدف از این مطالعه ایجاد پروتوکل ساده و ارزشمند برای القاء کالوس و باززایی این گیاه دارویی میباشد.
مواد و روش ها
مواد گیاهی
بذر گیاه بارهنگ کبیر از موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور تهیه گردید. بذور ابتدا سه دفعه با آب مقطر استریل شستشو داده شدند سپس با محلول تجاری هیپوکلریت سدیم %5 به مدت 10 دقیقه ضدعفونی شدند و مجدد با آب مقطر استریل شستشو داده شدند و در نهایت در اتانول %70 به مدت 30 ثانیه غوطه ور شدند و مجددا با آب مقطر استریل شستشو داده شدند.
بذور ضدعفونی شده در شرایط استریل بر روی محیط کشت موراشیگ و اسکوگ - - MS با %9 آگار و فاقد هورمونهای گیاهی، کشت گردیدند. pH محیط بر روی 5/8 قبل از اضافه نمودن آگار تنظیم شد و سپس بوسیله اتوکلاو در 121 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه استریل گردید. کشتها در اتاقک رشد با تناوب نوری 16 ساعت روشنایی و8 تاریکی در 25±2 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
کشت بافت
برای القاء کالوس و باززایی، از گیاهان رشد یافته یک ماهه استریل، ریز نمونههای برگ، ساقه و ریشه به طول 1-2 سانتی متر برش داده شدند و بر روی پتری دیشهای حاوی محیط کشت جامد MS حاوی ترکیب غلظت-های مختلف تنظیم کنندههای رشد گیاهی سیتوکینین 1 - TDZ، 1/5و2 میلی گرم بر میلی لیتر - و اکسین 0/5 - ،1، 1/5 و 2 میلی گرم بر میلی لیتر - IBA کشت گردیدند.
در هر تکرار 10 ریز نمونه کشت گردید. نمونهها در دمای25-2 درجه سانتیگراد و در شرایط استاندارد 16ساعت روشنایی شدت نور 2000 لوکس و 8 ساعت تاریکی قرار داده شدند. ریزنمونهها به محیط تازه هر دو هفته برای پیشگیری از قهوهای شدن انتقال یافتند و پس از القاء کالوس، ریزنمونهها به محیط MS با 0/5میلی گرم بر لیترTDZ برای القا شاخساره انتقال یافتند و شاخههای بدست آمده به محیط MS با - 0/5میلی گرم بر لیترIBA برای القاء ریشه انتقال یافتند.
آزمایشات فاکتوریل بر پایه طرح کاملا تصادفی با 3 تکرار و 10 ریزنمونه در هر پتری دیش انجام گرفت. داده ها توسط نرم افزار SPSS 16 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. میانگین ها با آزمون چند دامنهای دانکن در سطح احتمال - S 0.05 - مقایسه گردید.
نتایج و بحث:
از گیاهچههای چهار هفتهای برای گرفتن ریزنمونه استفاده گردید. آنها بر روی محیط MS جهت القاء کالوس و باززایی کشت شدند. بعد از چند بار واکشت متوالی، بعد از دو هفته، کالوسها در اغلب ریزنمونهها پدیدار گردیدند - شکل . - 1b ریزنمونهها به محیط MS با 0/5 TDZ میلی گرم بر لیتر برای القاء شاخساره انتقال یافتند، باززایی بعد از حدود 3-2 هفته مشاهده گردید - شکل. - 1 بالاترین فراوانی کالوسزایی - - %100 در برگ، در محیط MS حاوی ترکیبات 1/5:1/5 - و2:1 میلی گرم بر لیتر - TDZ: IBA و در ساقه غلظتهای 1 :0/5 - ، 1/5:1، 1/5:1:5، 1/5:2، 2:1، 2:2 میلی گرم بر لیتر - TDZ: IBA و در ریشه تمام غلظتها بجز - 1 :0/5 و 1:1/5میلی گرم بر لیتر TDZ: - IBA مشاهده شد.
بیشترین درصد باززایی در برگها - %100 - در ترکیب 1 :0/5 - ، 5:2/5:1،2:1/1،1 میلی گرم بر لیتر - TDZ: IBA و در ساقه - 1/5:1و 2:1 میلی گرم بر لیتر - TDZ: IBA و در ریشه - 2 : 1 و 2:2 میلی گرم بر لیتر - TDZ: IBA نشان داده شد - شکل - 2 و باززایی مستقیم و غیرمستقیم نیز برآورد گردید، بیشترین درصد باززایی مستقیم - %69/05 - و غیر مستقیم - %100 - در برگ بترتیب در - 1 :0/5 و 2:1 میلی گرم بر لیتر TDZ: - IBA دیده شد و در ساقه بترتیب در 2:1/5 میلی گرم بر لیتر - %16/67 - و 1/5:1 میلی گرم بر لیتر - %77/50 - و ریشه تنها پتانسیل باززایی غیر مستقیم از طریق کالوس را در 2:1 و 2:2 میلی گرم بر لیتر - %100 - نشان داد، در حالیکه بیشترین مقدار جوانه در هر ریزنمونه - برگ، ساقه و ریشه - بترتیب در ترکیب هورمونی - 41/67 - 1:2 و 2:2 میلی گرم بر لیتر - 21 - و - 9 - بدست آمد.
محققان در سال 1998 در تحقیق بر روی گیاه P.major ترکیبات مختلف تنظیم کنندههای رشد - 2,4-D, IAA, IBA, NAA and Kin - را به محیط MS اضافه نمودند و نتایج آنها گویایی تاثیر بهتر غلظتهای هورمونهای - 2 mg.l-1 برای تکثیر کالوس و - 0.5 mg.l-1 IAA + 1 mg.l-1 Kin - برای رشد ساقه و - 2 mg.l-1 IBA +1 mg.l-1 NAA - جهت ایجاد ریشه می-باشد
محققان دیگری در سال 2005 نیز ریزنمونههای برگ را برای القاء کالوس و تشکیل جوانه و ریشه با استفاده از ترکیبات NAA، BAP در محیط MS استفاده کردند و نتیجه بهینه آنها نشان دهنده این است که محیط MS به همراه 0/8 تا 1/2 میلی گرم بر لیتر NAA برای کالوس دهی و محیط MS به همراه 3/5 تا 4/5 میلی گرم بر لیتر BAP مناسب تشکیل جوانه و القاء ریشه در محیط - 1.2, MS 1.4 - میباشد
