بخشی از مقاله
چکیده
نشانگرمولکولی RAPD به منظور جداسازی نژادهای زنبورعسل Apis mellifera بومی ایران استفاده شد. استخراج DNA با استفاده از روش بهینه نمکی صورت گرفت و پس از سنجش کمی و کیفی DNA استخراج شده و رقیقسازی آن، مقادیر حاصل از باندهای بدست آمده بر روی ژل آگارز 2 درصد اجرا گردید و پس از تصویر برداری از ژل، نمرهدهی و آنالیز صورت گرفت.
نتایج نشان داد که باندهای مشاهده شده بین 250-2500 جفت باز قرار دارند و بیشترین باندهای مشاهده شده مربوط به گونه ی مرکزی با تعداد 44 باند تولیدی و کمترین باندهای مشاهده شده مربوط به اصفهان با تعداد 28 باند تولیدی میباشد. از میان آغازگرهای مورد استفاده بیشترین تعداد باند مربوط به آغازگر شماره 1 با تعداد 52 باند تولیدی و کمترین تعداد باند مربوط به آغازگر شماره 4 با تعداد 41 باند تولیدی می باشد.
آغازگر 4 با 100 درصد چندشکلی بیشترین چندشکلی و آغازگر شماره 2 با 61/5 درصد چندشکلی کمترین چندشکلی را دارا بود. آنالیز خوشه ای نژاد های مورد مطالعه آنها را در سه گروه اصلی قرار داد. نژادهای مرکزی، کردستان و خوزستان در گروه اول، فارس به تنهایی در گروه دوم و نژاد اصفهان نیز به تنهایی در گروه سوم قرار گرفت. در میان نژادها بیشترین شباهت بین خوزستان و کردستان - 0/64 - ، و بیشترین فاصله ژنتیکی - 0/5242 - بین نژاد اصفهان با هر چهار نژاد دیگر مشاهده شد. نشانگر RAPD تا حدودی توانست نژادهای مختلف را براساس ویژگیهای مورفولوژیکی و اقتصادی را از هم جداسازد.
.1 مقدمه
تعیین وضعیت ژنتیکی موجودات زنده زیربنای اصلاح نژاد آنها در هر منطقه است برای تعیین این وضعیت و تفکیک تودههای مختلف زنبور عسل در یک منطقه از روشهای مرفولوژیکی، تنوع پروتئین ها و DNA نگاری استفاده میشود.[1] برخی از تفاوتهای موجود در ردیفDNA بین دو موجود ممکن است به صورت پروتئینهایی با اندازههای مختلف تجلی کنند که بروشهای مختلف بیوشیمیایی قابل ثبت و رویت و مطالعه میگردند. این قبیل نشانگرها را نشانگرهای مولکولی در سطح پروتئین مینامند که از آن جمله میتوان به سیستم آیزوزایم/ آللوزیم اشاره کرد. اما دستهی دیگر از تفاوتهای موجود در سطح DNA هیچ تظاهری ندارند، نه صفت خاصی را کنترل میکنند و نه در ردیف اسیدهای آمینه پروتئینها تاثیری برجای میگذارند.
این دسته از تفاوتها را می توان با روشهای مختلف شناسایی، قابل دیدن و ردیابی کرد و به عنوان نشانگر مورد استفاده قرار داد. این نشانگرها که تقرباًی تعدادشان نامحدود است فقط از راه تجزیه وتحلیل مستقیم DNA قابل ثبت هستند و بنابراین به آنها نشانگرهای مولکولی در سطح DNA گفته میشود.[4;3] طی سالیان اخیر شناسایی و بررسی تنوع ژنتیک در بین گونههای حشرات بر اساس نشانگرهای مولکولی و روشهای مبتنی بر واکنش زنجیرهای پلیمراز PCR بسیار متداول گشته است. ولی در کشور ما بررسی تنوع مولکولی در زمینه حشره شناسی بسیار کم انجام گرفته است.
امروزه میکروساتلیت ها نقش مهمی در تعیین تنوع ژنتیکی و روابط خویشاوندی جانوران و گیاهانو مخصوصاً حشرات ایفا میکنند. زنبور عسل به شدت از هر دو منشاء فیلوژنتیک و تاکسونومی مورد مطالعه قرار گرفته است. در سال 1990 نشانگر RAPD مبتنی بر روش PCR به عنوان روشی برای تعییین ژنوتیپ افراد در مکانهای مختلف ژنی معرفی گردید.
در این روش با یک یا چند آغازگر کوتاه تصادفی، محصولاتی با اندازه های متفاوت براساس الگوی DNA در دو یا تعداد بیشتری از افراد تکثیر میشود. از آنجایی که با استفاده از 10 باز حدود یک میلیون نوع آغازگر میتوان درست کرد بنابراین با استفاده از آغازگرهای مختلف در هر واکنش چندشکلی های متفاوتی را باید در نظر داشت. اولین نقشه ژنتیکی برای زنبور عسل با استفاده از RAPDs ساخته شده است.[7] هدف از مطالعه حاضر، به منظور بررسی تنوع ژنتیکی برخی از جمعیتهای زنبور عسل ایران در پنج استان ایران با استفاده از روش RAPD بود.
.2 مواد و روشها
نمونه برداری از کلونیهای زنبورعسل استانهای خوزستان، کردستان، مرکزی، اصفهان و فارس انجام شد - شکل . - 1 استخراج DNA بروش بهینه نمکی بصورت زیر انجام شد. ابتدا پیکر زنبور توسط ازت مایع درون هاون چینی خرد شده و به تیوپهای 1/7 میکرولیتری منتقل خواهند شد، پس از افزودن 400 میکرولیتر بافر استخراج و40 میکرولیتر SDS، نمونهها به مدت 2 ساعت در دمای 65 درجه سانتیگراد درون حمام آب قرار گرفته و پس از افزودن 300 میکرولیتر NaCl و سانتریفیوژ نمونهها، فاز رویی جدا و به تیوپ تازه منتقل شده و به نمونهها کلروفرم افزوده خواهد شد. پس از سانتریفیوژ و جداسازی فاز رویی، اتانول مطلق سرد و استات سدیم 3 مولار به نمونهها افزوده خواهد شد و به مدت یک شب در دمای -20 درجه سانتیگراد نگهداری خواهند شد.
سپس نمونهها سانتریفیوژ شده و با الکل 70 درصد پلیت DNA شسته خواهد شد و در نهایت 50 میکرولیتر آب مقطر به نمونهها افزوده میشود، جهت اطمینان از کیفیت DNA و مشاهده قطعات DNAی استخراج شده از ژل آگارز 2 درصد و رنگ آمیزی توسط اتیدیوم برماید استفاده شد، همچنین کیفیت DNA استخراج شده توسط دستگاه اسپکتروفوتومتر نیز بررسی گردید.
شکل:1 پنج استان جمع آوری نمونهی زنبور عسل:-1 خوزستان -2 کردستان -3 مرکزی -4 اصفهان -5 فارس
واکنش زنجیرهای پلیمراز و الکتروفورز محصول : PCR با استفاده از 5 آغازگر - جدول PCR - 1 انجام شد. غلظت بهینه مواد به کار رفته در واکنش PCR در حجم کل 15 میکرولیتر به صورت 1/8 میکرولیتر DNA الگو، 1/5 میکرولیتر بافرPCR و مخلوط dNTP، 0/4 میکرولیتر MgCl2، 1 میکرولیتر آغازگر، 0/2 میکرولیتر Taq polymerase و در نهایت به میزان 8/6 میکرولیتر آب مقطر دوبار تقطیر به مخلوط اضافه گردید.
برنامه دمایی واکنش PCR به ترتیب یک مرحله به صورت 94 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه، 40 چرخه دمایی به صورت 94 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه، 40 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه، 72 درجه سانتیگراد به مدت 2 دقیقه و در مرحله نهایی 72 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه تنظیم گردید. سپس محصولاتPCR با ژل آگارز 2 درصد الکتروفورز گردید و توسط اتیدیوم برماید رنگ آمیزی شد و با استفاده از نور UV مورد ارزیابی و نمره دهی قرار گرفت
شکل :2 تصویر ژل آگارز 1/5 درصد آغازگر 4 با مارکر M=1Kb شکل :3 تصویر ژل آگارز 1/5 درصد آغازگر 3 با مارکر M=1Kb
محصولات حاصل از تکثیر در مرحله PCR، بهصورت اعداد صفر - عدم حضور باند - و یک - حضور باند - برای تمام جمعیتها با استفاده از نرم افزار اکسل 2007 امتیازبندی شد. تعداد باند چندشکل و تکشکل و درصد چند شکلی برای هر آغازگر و نژاد محاسبه گردید. برای نشان دادن کلاستر خوشهای و برای تعیین شباهت و تفاوت های ژنتیکی از برنامه NTsys 2.02 و Popgen 1.31، برای نشاندادن Butsterap از برنامه Winboot و برای نشان دادن Pcoa از برنامه FAMD 1.25 استفاده شد.
.3 نتایج و بحث
در بین پنج نژاد با هر چهار آغازگر، نژادهای کردستان با پرایمر یک و مرکزی با پرایمر سه بیشترین تعداد باند 13 - باند - را تولید کردند و نژاد اصفهان با پرایمر سه کمترین تعداد باند 4 - باند - را تولید کرد. هر چهار آغازگر 186 باند تولید کردند که نژاد مرکزی با هر چهار آغازگر 44 باند تولید کرد که بیشترین تعداد باند را در بین پنج نژاد دارد و نژاد اصفهان با تولید 28 باند کمترین تعداد باند را در بین هر پنج نژاد تولید کرد
