بخشی از مقاله
چکیده :
در این تحقیق تنوع ژنتیکی 23 جدایه قارچ F. solani با استفاده از نشانگرISSR بررسی و نتایج با گروههاي سازگار رویشی یا VCG جدایهها مقایسه شد. بعد از استخراج DNA قارچ و انجام PCR به کمک آغازگرهاي ISSR ، باندهاي واضح در تصاویر ژل مشخص شدند. 49 باند قابل رتبهبندي در دامنه2000-400جفت باز در 23 جدایه مورد بررسی تکثیر شد.
از 8 جایگاه شناسایی شده توسط این آغازگر، در 7 جایگاه چندشکلی مشاهده شد. بهترین روش گروهبندي با ضریب تشابه SM و روش UPGMA مشخص شد . برش دندروگرام در سطح تشابه %88 جدایهها را به 12 گروه تقسیم کرد که از a تا n نامگذاري شدند. گروههاي a، b، d، h، I، k و n دو عضوي، گروه g سه عضوي و بقیه گروهها تکعضوي بودند.
نتایج این بررسی با آزمون VCG جدایهها که قبلا انجام شده بود، مطابقتی نداشت و همینطور با مناطق جغرافیایی محل جمعآوري جدایهها و گروهبندي بیماري زایی آنها ارتباطی مشاهده نشد همچنین این نشانگر نتوانست جدایهها را به خوبی از هم تفکیک کند و تنوع ژنتیکی پایینی از این قارچ نشان داد.
مقدمه :
گوجه فرنگی زراعی - Lycopersicon esculentum Mill. - ، یکی از محصولاتی است که به تازگی به لیست محصولات غذایی جهان اضافه شده است و در طی قرن گذشته با تولید سالانهي حدود 50 میلیون تن، یکی از محبوب ترین سبزيها محسوب میگردد - . - 2 از قارچهایی که باعث پوسیدگی طوقه و ریشهي گوجهفرنگی میشود، قارچ Fusarium solani - Martius - Appel & Wollenweber emend. Snyder & Hansen که مرحلهي جنسی آن Haemanecteria haematococca - Barkeley & Broome - Samuels & Nirenberg. - Nectria haematococca. - است.
این بیماري اولین بار در سال 1988 و از Central Queensland استرالیا توسط واودري1 و پترسون2 گزارش شده است - . - 6 در دنیا جز تحقیقی که توسط رامبرگ و دیویس - 5 - انجام شده و تنها چند جدایه از این قارچ براي VCG و کار مولکولی استفاده شده است، تحقیقی از طریق VCG و کار مولکولی روي آن صورت نگرفته است. تحقیقات درباره این بیماري در ایران در حد جداسازي، شناسایی و اثبات بیماريزایی جدایههاي قارچ عامل بیماري بوده است. براي اولین بار در سال 1386 این قارچ از ایران به عنوان عامل پوسیدگی طوقه و ریشه گوجهفرنگی گزارش شد
در دنیا استفاده از نشانگر ISSR در مطالعهي حاضر براي اولین بار براي بررسی تنوع ژنتیکی F. solani عامل پوسیدگی طوقه و ریشه گوجهفرنگی صورت گرفته است. بقایی راوري و همکاران در مطالعهاي با استفاده از نشانگرهاي ISS، ISSR و RAPD تنوع ژنتیکی جدایههاي قارچ F. solani عامل پژمردگی و پوسیدگی خشک فوزاریومی سیب زمینی را در استانهاي خراسان شمالی و رضوي بررسی کردند.
در این بررسی از 28 جدایه مورد بررسی، 6 جدایه VCG آنها قبلا توسط محقق دیگري تعیین شده بود، نتایج تجزیه کلاستر حاصل از RAPD و ISSR یافتههاي حاصل از VCG را تایید کرد ولی نشانگر ISS دو جدایه با VCG یکسان را از هم تفکیک کرد و برش دندروگرام در سطح %75 جدایهها را در ISS به 22 گروه، در RAPD به 16گروه و در ISSR به 18گروه تقسیم کرد که کارایی بیشتر نشانگر مطالعه حاضر در تفکیک جدایهها نسبت به RAPD را نشان میدهد . - 1 - از سري نشانگرهاي مبتنی بر PCR، ریزماهوارهها میباشند که از قدرت تمایز بسیار بالایی برخوردارند.
ریزماهوارهها مناطقی از DNA ژنومی هستند که از تکرار توالی خاص تشکیل شدهاند و براساس طول توالی تکرار شونده مینیساتلایت یا میکروساتلایت نامیده میشوند . - 4 - از این روش براي مطالعه تنوع درون گونهاي جدایههاي F. solani توسط برسیلیرو و همکاران استفاده شده و بالاترین میزان چندشکلی را بین جدایههاي این قارچ نشان داد
برسیلیرو و همکاران - 3 - با بکارگیري توالیهاي تکرار شونده - GTG - 5 بعنوان آغازگر در واکنش زنجیرهاي پلیمراز، چندشکلی بالایی بین گونه Saccharomyces cervisiae و جدایههاي مختلف این قارچ شناسایی کردند و آنرا به اختصار SPAR1 نامیدند که در واقع همان نشانگر ISSR2 میباشد. این روش قابلیتهاي بالایی در ارزیابی بیمارگرهاي مختلف نشان داده است
با توجه خسارت ناشی از این بیماري در خوزستان و اهمیت گوجهفرنگی در ایران و جهان، تحقیق درباره قارچ F.solani عامل بیماري پوسیدگی طوقه و ریشه گوجهفرنگی ضروري به نظر میرسد. هدف از انجام این مطالعه، بررسی تنوع ژنتیکی جدایههاي قارچ F.solani عامل پوسیدگی طوقه وریشه گوجهفرنگی در استان خوزستان به کمک نشانگر ISSR و رابطه آن با VCG و بیماريزایی ومناطق جغرافیایی میباشد.
مواد و روشها :
جداسازي و شناسایی و خالصسازي : جمعآوري گیاهان آلوده گوجهفرنگی از شهرهاي مختلف خوزستان انجام و جداسازي قارچ از ریشههایی که علائم بیماري را نشان میدادند، با استفاده از محیط کشت انتخابی Nash & Snyder صورت گرفت. همینطور خالصسازي جدایهها با استفاده از تکاسپور کردن آنها روي محیط کشت CLA انجام شد. شناسایی جدایهها روي محیط کشت برگ میخک-آگار - CLA - و محیط کشت PDA انجام گرفت.
تعیین گروههاي سازگار رویشی و آزمون بیماريزایی جدایهها : گروههاي سازگار رویشی - VCG - بدینصورت انجام گرفته بود که براي تولید موتانتهاي نیت از محیط کشت زاپک-کلرات %6 حاوي رزبنگال استفاده شد. بعد از تعیین کلاس فنوتیپی موتانتهاي نیت مختلف، مکملسازي بین موتانتهاي نیت جدایههاي مختلف صورت گرفت و VCG جدایههاي مختلف تعیین شد. همچنین بیماريزایی جدایهها طی آزمون بیماريزایی ثابت شد.
مطالعه تنوع ژنتیکی جدایهها به کمک نشانگر : ISSR بدینمنظور استخراج DNA قارچ مطابق روش ویلند - 8 - صورت گرفت. آغازگر ISSR با توالی - GTG - 5 - شرکت سیناژن - براي مطالعه تنوع ژنتیکی در این مطالعه به کار برده شد. تکثیر DNA در واکنش 25 میکرولیتري شامل 2/5 میکرولیتر بافر 20 - PCR 10X میلیمولار Tris-HCl با PH = 8، 50 میلیمولار - KCl، 1/5 میلیمولار MgCl2، 0/25 میلیمولار مخلوط dNTP، 25 پیکو مول آغازگر، 50 نانوگرم DNA ژنومی و 1/25 واحد آنزیم تکپلیمراز در دستگاه ترموسایکلر - Biometra, Germany - با برنامه حرارتی 5 دقیقه در 93 درجهسانتیگراد، 40 سیکل با 20 ثانیه در 93 درجهسانتیگراد، 45ثانیه در 55 درجهسانتیگراد، 90 ثانیه در 72 درجهسانتیگراد و مرحله تکثیر نهایی با 6 دقیقه در 72 درجهسانتیگراد انجام شد.
در یک واکنش به جاي DNA ژنومی از آب مقطر سترون براي کنترل آلودگی استفاده گردید. انجام الکتروفورز با استفاده از آگارز 1 درصد و طی زمان 2 ساعت انجام و تصاویري از باندها تهیه شد و باندهاي واضح در تصاویر ژلها مشخص گردید. دادهها به برنامهexcel به صورت کدهاي یک و صفر که معرف حضور و عدم حضور باندها بودند، منتقل و ماتریس دادههاي یک و صفر تهیه گردید. تنها باندهاي تکرار پذیر براي تجزیه و تحلیل انتخاب شدند که چندشکلی نشان داده بودند و مکانهاي تکشکل حذف شدند. در این تحقیق توسط نرم افزار NTSYSpc 2.02 ماتریس تشابه بین جفت جدایهها به کمک ضرایب تشابه جاکارد، دایس، تطابق ساده - SM - و K1 محاسبه و از سه روش خوشه بندي UPGMA، SINGLE Linkage و COMPLETE Linkage استفاده گردید.
نتایج و بحث :
79 جدایه جداسازي شده که براي تعیین VCG در آزمایشات قبلی به کار رفته بود در20 گروه VCG قرار گرفتند، 9 جدایه از آنها خودناسازگار تشخیص داده شدند و 13 گروه آنها تکعضوي بودند و 23 جدایه از آنها بدینشکل انتخاب شد که 4 جدایه از گروههاي تکعضو و 3 جدایه خودناسازگار از شهرهاي مختلف و 16 جدایه از گروههاي مختلف چند عضوي و از شهرهاي مختلف براي کار با نشانگر و بیماريزایی انتخاب شدند.
با توجه به اینکه براي تجزیهخوشهاي جدایهها از ضرایب و روشهاي مختلف خوشه بندي استفاده شده بود، بهترین گروهبندي با استفاده از ضریب SM و روش تجزیه خوشهاي UPGMA بدست آمد. حداقل تشابه بین جفت جدایهها 0/14 و حداکثر تشابه یک بود. حداقل تشابه بین جدایه 13 با جدایههاي 56و9و60 با ضریب تشابه 0/14 و حداکثر تشابه بین جدایههاي 66و24، 26و32، 20و11، 5و47 و8، 45و53، 79و67، 56و60، 38و60 با ضریب تشابه یک بود.
برش دندروگرام در سطح تشابه %88 جدایهها را به 14گروه ژنتیکی تقسیم و گروهها از a تا n نامگذاري شدند. گروههاي a، b، d، h،i، k و n دو عضوي گروه g سه عضوي و بقیه گروهها تکعضوي بودند. در این روش در مجموع 49 باند قابل رتبهبندي در دامنه 2000-400جفت باز به وسیله آغازگر ISSR در 23 جدایه مورد مطالعه تشکیل شد. تعداد کل لکوسهاي تکثیر شده توسط این آغازگر 8 لکوس شمارش شد که در 7 جایگاه تنوع دیده شد.
مقایسه نتایج تجزیه خوشهاي جدایهها با نشانگر ISS و VCG و مناطق جغرافیایی : در گروهبندي ایجاد شده از نشانگر ISSR مطابقتی بین این گروهبندي و VCG و بیماريزایی و منطق جغرافیایی محل جمعآوري جدایهها مشاشده نشد. از دلایل اینکه نشانگر ISSR نتوانسته است حتی تا حدي ارتباطی با VCG نشان دهد این است که احتمالا لکوس مربوط به VCG و لکوسی که آغازگر تکثیر کرده است روي ژنوم در کنار یکدیگر قرار ندارند بنابراین ارتباطی بین گروهبندي حاصل از ISSR و VCG مشاهده نشد و عدم ارتباط بین بیماريزایی جدایهها و تنوع ژنتیکی آنها با استفاده از این نشانگر در این تحقیق و تحقیقات مشابه را میتوان به همین دلیل دانست زیرا ممکن است نواحی از ژنوم قارچ تکثیر پیدا کند که ارتباطی با ژن بیماريزایی نداشته باشد.
از دلایل دیگر این امر آن است که این نشانگرکل ژنوم را پوشش نمیدهند یعنی براي اینکه ما مطابقت بیشتري با VCG ببینیم باید تعداد آغازگرها را افزایش دهیم. پس به احتمال زیاد افزایش تعداد آغازگرها و افزایش تعداد جدایه ها قادر به حل این موضوع می باشد. بنابراین به نظر میرسد استفاده از نشانگرهایی همانند AFLP، RFLP و RAPD میتواند در مطالعه تکمیلی تنوع ژنتیکی این قارچ و گروهبندي دقیقتر آن موثر باشند. همچنین این نشانگر نتوانست تفاوت بین جدایهها را به خوبی نشان دهد. با توجه به اینکه تنوع ژنتیکی این قارچ توسط نشانگر ISS در آزمایشات قبلی انجام شده تجزیه ترکیبی ISS-ISSR جدایهها را در سطح 76 درصد به 16 گروه تقسیم کرد یعنی تجزیه ترکیبی دادههاي این نشانگرها این جدایهها را تا حدي از هم تفکیک کرد.
