بخشی از مقاله
چکیده
امروزه از نشانگرهاي مولکولی در سطح وسیعی استفاده میشود. این تکنیکهاعمدتاً براي نقشهیابی ژنی، تشخیص ژنوتیپهاي مطلوب، مطالعات تکوینی و فیلوژنتیک در گیاهان بکار برده میشوند. در این راستا پس از استخراج DNA از گیاه، نیازمند یک روش مناسب جهت تکثیر توالی قطعات DNA میباشد. چندشکلی تکثیر اختصاصی - ISSR - DNA یک روش ساده و قابل اعتماد براي تشخیص پلی مورفیسم DNA است و بطور گسترده اي در مطالعات تنوع ژنتیکی با استفاده از آغازگرهاي بلند بکار گرفته میشود.
در پژوهش حاضر که براي اولین بار در ایران صورت پذیرفت، واکنش ISSR و شرایط بهینهسازي چرخه دمایی براي تولید قطعات تکثیر ISSR از گیاه مامیران - Chelidonium majus - مورد بررسی قرار گرفت. براي تعیین شرایط بهینه، غلظتهاي مختلف MgCl2، DNA الگو، آنزیم Taq پلیمراز، پرایمر، dNTPs و همچنین برنامههاي مختلف چرخه دمایی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.
با توجه به نتایج حاصله بهترین الگوهاي باندي تجدیدپذیر با استفاده از 0/94 میکرولیتر از پرایمر، MgCl2 به مقدار 0/7 میکرولیتر، 2 میکرولیتر از DNA الگو ، 0/37 میکرولیتر dNTPs و 0/2 میکرولیتر Taqپلیمراز، که به حجم 12/5 میکرولیتر میرسانده شده بودند بدست آمد. از 5 آغازگر استفاده شده، 3 آغازگر ISSR-8، ISSR-14 و ISSR-2 پلیمورفیسم را به صورت باندهاي واضح نشان دادند. در نهایت با توجه به نتایج حاصل، واکنش ISSR -PCR بهینهسازي شده را میتوان در تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی گیاه مامیران مورد استفاده قرار داد.
مقدمه:
گیاه دارویی مامیران با نام علمی Chelidonium majus - که در آمریکا به blood root و در اروپا به tetterwrot شناخته شده است - از خانواده Papaveraceae، گیاهی چند ساله است که تنها یک گونه - - majus دارد .[9] این گیاه بومی اروپا و غرب آسیا و به طور گسترده در شمال آمریکا رویش دارد. ساختار رویشی آن به صورت راست و به ارتفاع 30 تا 120 سانتی متر، داراي برگهاي لبه دار و مواج، تقریبا به اندازه 8-5 سانتی متر، با گلهایی متشکل از 4 گلبرگ زرد که هر کدام در حدود 1 سانتی متر بلندي دارد و با دانه هاي کوچک و سیاه و سفید که در داخل کپسول قرار دارند می باشد
گروه هاي مختلف مولکول هاي شیمیایی در مامیران دیده می شود. گیاه دارویی مامیران کاربرد زیادي در طب سنتی براي بیماري هاي کبدي دارد و همچنین داراي خاصیت ضد قارچی، آنتی باکتریال، تاثیرات ضد توموري و ضد سرطان [5] ، موثر براي درمان زگیل [7]، ضد درد و محرك سیستم ایمنی می باشد.
متاسفانه بسیاري از گونههاي گیاهی دارویی حتی قبل از شناسایی آنها منقرض شدهاند . - 8 - امروزه خطر انقراض گیاهان به عنوان ذخایر ژنتیکی ارزنده لزوم بررسی و حفظ این مخازن ژنی را دوچندان کرده است. از این رو محققان به دنبال استفاده از روشهاي نوین بیوتکنولوژي در جهت ارایه راهکارهاي حفاظت ژنتیکی گیاهان میباشند .[1] واکنش زنجیرهایی پلیمراز - PCR - در مطالعات ژنتیک و بیولوژي مولکولی انقلابی ایجاد کرده است .[3] اما دستیابی به تکثیر موفقیتآمیز و نتایج تکرارپذیر به عوامل مختلفی نظیر کمیت و کیفیت DNAي الگو و قطعات تکثیر حاصل از واکنش زنجیرهایی پلیمراز بستگی دارد
تاکنون روشهاي مختلفی جهت بهینهسازي واکنش زنجیرهایی پلیمراز معرفی شده است که روش Sijapati و همکاران - 2008 - از این جمله است .[17] علیرغم دستورالعملهاي کارآمد جهت بهینهسازي واکنش زنجیرهایی پلیمراز تاکنون بررسی در زمینه انجام فعالیتهاي مولکولی در گیاه مامیران در ایران انجام نپذیرفته است که این تحقیق روش مناسب جهت انجام بهینه واکنش زنجیرهاي پلیمراز با نشانگر مولکولی ISSR را معرفی میکند.
مواد و روشها
مواد ژنتیکی مورد مطالعه، DNA نمونههاي استخراجی از برگ جوان گیاه مامیران میباشد که در آزمایشگاه اصلاح نباتات دانشگاه علوم کشاورزي و منابع طبیعی ساري در بهمن ماه 1391 مورد آزمایش قرار گرفتند. استخراج DNA بر اساس روش تغییر یافته CTAB انجام پذیرفت .[2] به این صورت که نمونههاي جمع آوري شده را با آب مقطر شستشو میدهیم. حدود 200 میلیگرم از نمونه برگی را در هاون چینی بوسیله ازت مایع به طور کامل پودر میکنیم.
700 میکرولیتر بافر استخراج DNA، 40 میکرولیتر PVP و 20 میکرولیتر مرکاپتواتانول به تیوب حاوي نمونههاي پودر شده اضافه نموده - بافر استخراج قبل از اضافه شدن در دماي 65 درجه سانتی گراد گرم شود - و به مدت 45 دقیقه در حمام بن ماري قرار میدهیم و هر 5 دقیقه نمونهها را به آرامی تکان میدهیم. سپس به هر نمونه 700 میکرولیتر محلول - فنل - ایزوآمیل الکل:کلروفورم به ترتیب به نسبت 24:1 اضافه میکنیم و نمونهها را به مدت 10 دقیقه با شدت rpm 13000 سانتریفیوژ میکنیم.
در ادامه با انتقال فاز رویی به درون یک تیوب جدید و اضافه نمودن ایزوپروپانول سرد هم حجم با فاز رویی همراه با 50 میکرولیتر استات سدیم و اینورت نمودن نمونهها به آرامی باعث رسوبدهی DNA میشویم. در این مرحله نمونهها را جهت رسوبدهی و عملکرد بالاتر، به مدت 24 ساعت در دماي -20 درجه سانتیگراد نگه داشته و سپس اقدام به انجام مراحل بعد مینمائیم.
نمونهها سپس به مدت 15 دقیقه با شدت rpm 13000 سانتریفیوژ شده و با دورریختن فاز رویی نمونه، رسوب DNAي داخل تیوب را با الکل %70 شستشو و پس از خالی کردن الکل و خشک کردن تیوپ، مقدار 100 ماکرولیتر آب دیونیزه به تیوپ ها اضافه و پس از گذشت 2ساعت در دماي اتاق، فاز حل شده حاوي DNA را به تیوپ دیگر منتقل، و در دماي -4 درجه سانتیگراد نگهداري میکنیم، تا به تعیین کیفیت و کمیت آن اقدام نماییم. کمیت وکیفیت DNAهایی که با روشهاي فوق استخراج شدند با استفاده از روشهاي اسپکتروفتومتري [6] و ژل آگارز مورد بررسی قرار میگیرند.
نتایج حاصل نشان داد که DNA استخراج شده بر روي ژل فاقد اسمیر و شکستگی بودند - شکل . - 1 پس از استخراج اقدام به انجام واکنش PCR میکنیم. واکنش نهایی PCR در حجم 12/5 میکرولیتر انجام پذیرفت به این صورت که مقدار 2 میکرولیترDNA الگو، 0/7 میکرولیتر MgCl2، 1/25 میکرولیتر PCR Buffer، 0/32 dNTPs میکرولیتر، پرایمر 0/94 میکرولیتر، آنزیم Taq پلیمراز /2میکرولیتر0 و نهایتاً حجم محلول را به 12/5 میکرولیتر میرسانیم. چرخه دمایی واکنش در 35 سیکل انجام میشود و هر سیکل نیز به این ترتیب شامل: 95/5 درجه واسرشتسازي اولیه به مدت 7 دقیقه ، 92 درجه براي تک رشتهایی شدن DNA در 1 دقیقه، 47 درجه براي اتصال آغازگر به توالی DNA در 1 دقیقه - بستگی به پرایمر - ، 72 درجه براي تکثیر آغازگر به مدت 1 دقیقه و 72 درجه جهت تکثیر نهایی آغازگر به مدت 5 دقیقه - جدول - 2می باشد. پس از پایان واکنش نمونهها را بر روي ژل آگارز 1/5 درصد[8] جهت مشاهده توالیهاي تکثیر شده قرار میدهیم
شکل -1 نمونه الگوي دي ان آي استخراج شده از تعداد دوازده ژنوتیپ مامیران بر روي ژل % 0/7 آگاروز
شکل-2 نمونه واکنش PCR براي تعداد بیست ژنوتیپ جمع آوري شده مامیران
جدول :1 مشخصات مخلوط واکنش تهیه شده PCR
