بخشی از مقاله
خلاصه:
باکتري E.coli O157:H7 انتروهموراژیک بعنوان باکتريFood – borne است که باعث اسهال خونی وسندرم اورمیک خونریزي دهنده میشود که پس ازچسبیدن به سلولهاي روده ایجادبیماري میکند. جلوگیري ازچسبیدن باکتري به سطح سلول ازراههاي مهم پیشگیري از گسترش بیماري درحیوان ودرنتیجه کنترل بیماري درانسان است. Loc9 ازژنهاي مربوط به فیمبریاي باکتري E.coli O157:H7 است که درچسبیدن نقش عمده دارد. درتحقیق حاضرپس ازتکثیرژن موردنظرآنرا واردیک قطعه پلاسمیدکرده وسپس پلاسمید بهمراه قطعه ژن به باکتري E.coli K-12 منتقل شد. پس ازرشدباکتري روي محیط حاوي آنتی بیوتیک کلنی هاي کلون گرفته راجمع آوري کرده پس ازرشدمجدد بااضافه کردن IPTG ژن واردشده درباکتري بیان گردید.
درSDS-Page حاصل ازمحصول بیان ژن، تفاوت باندها با نمونه اولیه باکتري بدون دریافت ژن کاملا مشخص است.
مقدمه :
اشریشیا کلی آنتروهمورلوژیک که بعنوان پاتوژن مهم روده اي شناخته شده در20 سال گذشته درکشورهاي پیشرفته بسیارمشکل سازبوده است و درنهایت اسهال خونی وعفونت روده منجربه عوارض شدیدکشنده بویژه درکودکان وافرادمسن میشود. این باکتري پس ازکلونیزه شدن درروده وچسبیدن به گیرنده هاي مخصوص درعروق خونی روده وکلیه بوسیله تولیدتوکسین کشنده اي بنام Shiga Toxin ایجادبیماري میکند.
تولیدتوکسین ازویژگیهاي شناخته شده این باکتري است امابرخی خصوصیات آن بویژه مکانیسم چسبیدن به دیواره سلولهاي اپیتلیوم هنوز بطورکامل شناخته نشده است. پدیده اي تحت عنوان چسبندگی وازبین بردن پرزهاي روده - Attachment and Effacement: A/E - دراین باکتریها وجود دارد.
این پدیده داراي خصوصیات ازدست دادن پرزهاي روده سلولهاي میزبان یا Effacement وچسبیدن ذاتی باکتري به سلول میزبان - Attachment - میباشد.تمام ژنهاي لازم براي تشکیل A/E توسط نواحی خاصی تحت عنوان Locus of Entrocyte Effacement - LEE - نام دارد. یکی از Locus هاي مهم که درچسبیدن دخالت دارد Loc شماره 9 میباشد که درحال حاضرمشکوك بعلت مهم چسبیدن باکتري است.
تحقیق حاضرروشی جهت جلوگیري ازچسبیدن باکتري ودرنتیجه جلوگیري ازایجادبیماري بوسیله پروتئینی است که پس از تزریق، خاصیت آنتی بادي تولیدمیکند. دراین روش Loc 9 رادرباکتري E.coli K-12کلون کرده وپس ازبیان ژن درباکتري محصول بدست خواهدآمد.
مواد وروش کار:
باکتري E.coli k12 که قبلا پلاسمیدp NJH38 واردآن شده تهیه کرده - این پلاسمید حاوي یک قطعه ژن بنام PaPB وژن مقاوم به آمپی سیلین است . بااستفاده از کیت Plasmid prep - Mini - - QI prep spin - Miniprep Kit پلاسمیدخالص سازي شد. اندازه پلاسمید3/8Kb میباشد. سپس توسط آنزیمهاي BamH1 و Hind III جداگانه اقدام بعمل هضم آنزیمی شد - Digestion - بااین عمل قطعه PaPB خارج میشود.
ژن مورد نظرجهت واردکردن به پلاسمیدLoc9 نام داردکه مربوطه به فیمبریاي باکتري E.coli O157: H7 است. پس ازتکثیرژن موردنظرتوسط فرآیندPCR که باندهاي 480bp میدهدمراحل بعدي آغازشد.هردوقطعه پلاسمیدوژن Loc9 بوسیله آنزیم Bam H1 هضم گردیدوسپس توسط کیت QIquick PCR Purification خالص سازي انجام شد. درمرحله دوم قطعات Clean upشده توسط آنزیم Hind III هضم وسپس Clean up صورت گرفت.
تمام مواردهضم شده روي ژل برده وپس ازبریدن قطعات باندوخالص سازي عملیات بعدي انجام گرفت.به منظور اطمینان بیشترپس ازبریدن قطعات باندوخالص سازي، مقدارکمی ازپلاسمیدومحصول PCR ژن Loc9 مجددا روي ژل برده تا ازدقت کار اطمینان حاصل شود.
اتصال:
جهت انجام عملیات Ligation یا اتصال قطعه ژنی موردنظربه پلاسمیدموادزیرموردنیازبود. محصول PCR یا همان ژن Loc9 تکثیریافته که بادوآنزیم مذکورهضم وسپس Clean up شده است.پلاسمیدکه همینطوربادوآنزیم فوق هضم وCleah up شده است.آنزیم -T4 Ligation بافر T4 وآب مقطر. مدت زمان Ligation یکشب دردماي 16 درجه سانتی گرادبود.
نظربه اینکه قطعه ژن PaPB و Loc9 تقریبا هم اندازه بودپس ازاتصال می بایست مشخص شودآیا قطعه ژنی جدیدواردپلاسمیدشده است یاخیر.به همین منظور ازآنزیم Hinc II استفاده شد.این آنزیم برروي سکانسهاي PaPB اثري ندارداما سکانسهاي Loc9 به گونه اي است که توسط این آنزیم برش می خورند.پس ازطراحی پرایمرموردنظرعملیات PCR برروي قطعه پلاسمیدي حاوي ژن Loc9 وهمچنین پلاسمیدي که ازاول ژن PaPB داشته انجام گرفت.
:Transformation
ازباکتري E.coli AAEC185 جهت انتقال پلاسمیدي که حاوي قطعه ژنی Loc9 است استفاده شد. باکتري روي محیط حاوي آنتی بیوتیک آمپی سیلین وبدون آنتی بیوتیک کشت شد.درنهایت پس ازرشدباکتري روي محیط حاوي آنتی بیوتیک عملیات خالص سازي DNA باکتري انجام گرفت وسپس برروي DNA خالص شده PCR انجام شد.به منظورآگاهی یافتن ازواردشدن قطعه Loc9 به پلاسمیدوانتقال پلاسمیدبه باکتري واینکه آیااین باکتري حاوي قطعه پلاسمیدجدیدقابل تکثیراست یاخیر,عملیاتPCR برروي DNA باکتریهاي دریافت کننده پلاسمیدحاوي قطعه ژنی - Loq9 - وهمچنین پلاسمیدي که ازاول ژن PaPB دارد انجام گرفت.
بیان ژن
تمام لوله هایی که حاوي باکتري E.coli AAEC185 باقطعه انتقال یافته وبدون آن - به منظورکنترل - رابه مدت یکشب درمحیط کشت باآنتی بیوتیک آمپی سیلین وبدون آن قرارداده شد.سپس رقت 1/100 ازهرکدام تهیه ومجددا درمحیط کشت حاوي آنتی بیوتیک وبدون آن بطور جداگانه قرارگرفت. پس ازاینکه جذب آن درطول موج 600 نانومتربه 0/2 – 0/3 رسیدماده IPTG اضافه کرده وبه مدت 3 ساعت اجازه رشدداده شد.
سپس عملیات جمع آوري وسانترفیوژ انجام گرفت و رسوب آن که بعنوان محصول بیان ژن یاهمان پروتئین است فریزشد، مقداري ازآن برروي ژل SDS-Page برده شدتابانمونه اصلی مقایسه گردد.
نتایج:
هضم آنزیمی پلاسمیدواندازه آن که 3/7 kb است - حدود 100 bp به دلیل هضمهاي آنزیمی ازدست میرود - بادوآنزیم Hind III, BamH1 انجام گرفت تصویر.1 تکثیرژن Loc9 بوسیله PCR که 480 bp اندازه دارد درتصویر2 مشخص است. هضمهاي آنزیمی پلاسمید و Loc9 توسط آنزیم هاي BamH1 و HindIII درتصویر3 مشخص می باشد.تصویر4 باندهاي مربوط به بریدن قطعات پلاسمیدو Loc9 ازروي ژل پس از Clean up رانشان میدهد. بدلیل مقدارکم محصول استفاده شده درPCR باندهاي Loc9 نامشخص ولی باندپلاسمیدبصورت ضعیف مشخص شده است.
:Ligate checking پس ازعملیات اتصال سه احتمال وجودداشت: -1پلاسمیداولیه بدون هیچگونه برش ودرنتیجه بدون قطعه ژنی جدید. یعنی پلاسمیدباهمان قطعه ژنی اولیه -2 . PaPB پلاسمیدباقطعه ژنی جدیدیعنی -3 . Loc9 پلاسمیدبدن هیچ نوع قطعه ژنی یعنی دوسرپلاسمیدخودش به هم اتصال یافته است.
تصویرشماره 5 باندهاي مربوط به هضم پلاسمیدباقطعات جدیدوقدیم توسط آنزیم BamH1 و HindIII رانشان می دهد، همانطورکه واضح است دوآنزیم HindIII , BamH1 برروي Loc9 و PaPB اثریکسان داشته وتمام باندهاي مساوي است.
تصویر6 همین عملیات رابرروي پلاسمیدهاي فوق با آنزیمHinc II مشخص میسازد. این آنزیم برروي سکانسهاي PaPB اثري ندارداماسکانسهاي Loc9 به گونه اي است که توسط این آنزیم برش میخورد.بنابراین این در خط 2 هیچگونه باندي مشاهده نمی شود که این مربوط به پلاسمیدباقطعه PaPB است اما خطوط اول سوم،چهارم وپنجم پلاسمیدمربوط به قطعه ژنی جدیدیعنی Loc9 است.
تصویر7 نتایج عملیات PCR بااستفاده ازپرایمرجدیدطراحی شده برروي DNA باکتریهاي دریافت کننده قطعه پلاسمیدهاي ژن Loc9 وپلاسمیدي که ازاول ژن PaPB داشته رانشان میدهد. خط اول مربوط به باکتري باپلاسمیدحاوي قطعه ژنی PaPB باندازه 370 وخطوط 3و5 مربوطبه باکتري باپلاسمیدحاوي Loc9 باندازه 480 bp است وخطوط2و4 دلالت برعدم دریافت قطعه موردنظرازطرف پلاسمیدوعدم انتقال به باکتري دارد. خط 6 نیزکنترل منفی است.باکتري حاوي پلاسمیدباقطعه جدیدوقدیم روي محیط بدون آنتی بیوتیک وحاوي آنتی بیوتیک کشت داده شد. باکتریهایی که قطعات جدیدژنی Loc9 رادرپلاسمیددریافت کرده بودند حاوي ژن مقاوم به آمپی سیلین نیزهستندبنابراین برروي محیط حاوي آنتی بیوتیک رشدداشتند.
این باکتري راجمع آوري وتکثیرداده وپس ازخالص سازي DNA جهت عملیات بعدي استفاده شد.
تصویر8 - ژل - SDS-Page همانطورکه مشخص است خط اول کنترل منفی مربوط به باکتري اولیه E.coli AAEC 185 است، خطوط 3 و5 باکتري حاوي قطعه جدیدژنی وخطوط 2و4 مربوط به کلونهاي منفی است که تفاوت باندهاکاملا مشخص است واین نشان دهنده بیان ژن است.
بحث:
باکتري هاي E.coli مرتبط باکولیتهاي همولوژیک داراي خصوصیات عمده اي ازجمله دارابودن آنتی ژن H7 هستندکه سایرین فاقدآن می باشند. Loc9 از ژنهاي مربوط فیمبریاي باکتري است که اخیراً درچسبیدن باکتري به سطح سلول نقش عمده اي براي آن درنظرگرفته شده است. ازآنجا که دلیل اصلی ایجادبیماري توسط این باکتري درمرحله اول چسبیدن ولکالیزه شدن وسپس تولیدسم شیگا است. بنابراین واضح است اگربتوان به هردلیلی ازچسبیدن باکتري جلوگیري بعمل آورد مطلوب حاصل شده است. نقش کلیدي Locus ها درتحقیقات مختلف به اثبات رسیده است
