بخشی از مقاله
مقدمه
امولسیونهاي فلزکاري (Metal Working Fluids=MWFs)
در صنعت معمولاً براي سوراخ کردن، بریدن، ضربه زدن، ساییدن و صاف کردن ترکیبات فلزي به ابعاد با ارزش استفاده میشوند 3) و .(5 امولسیونهاي فلزکاري حاوي روغنها و افزودنیهایی مانند بیوسایدها، بافرهاي تنظیم کننده
pH، سورفاکتانتهاي معلق، عوامل ضد کف، بازدارندههاي فساد تدریجی، بازدارندههاي خوردگی، امولسیفایرها میباشند. این ترکیبات ویژگیهایی مانند: پایداري، لیز کنندگی، خاصیت ضد ساییدگی و توانایی ضدکف و قابلیت برطرف کردن ضایعات را به آنها میدهند 13) و .(15
در هنگام عملیات تولید فلز، حرارت تولیدي و واکنش پذیري تراشهها منجر به تجزیه امولسیون فلزکاري میشود.
از نظر شیمیایی ذرات با روغنهاي امولسیون واکنش داده و باعث شکسته شدن امولسیون و همچنین موجب تسهیل در رشد باکتریها و قارچها میشود. باکتریها از امولسیون، مواد افزودنی و روغن به عنوان غذا استفاده مینمایند که منجر به تجزیه بیشتر خنک کننده می شود. در اثر فساد امولسیون فلزکاري، کارآیی روان کنندگی و انتقال حرارت آن نیز کاهش مییابد .(10) اصلیترین منبع غذایی میکروارگانیسمهاي موجود در MWFs، کربن موجود در روغنهاي نفتی، اسیدهاي چرب و دیگر مواد آلی موجود در
353
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 3، 1392
مایع فلز کاري است. وجود آب، انواع هیدروکربنهاي پیچیده و نمکهاي معدنی میتوانند شرایط مناسبی را براي رشد باکتریها و قارچها فراهم آورد .(7)
در بیشتر پژوهشهاي انجام شده باکتریهاي گرم منفی به ویژه گونههاي مختلف سودوموناس و آسینتوباکتر به عنوان باکتریهاي غالب تخریب کننده امولسیونهاي فلزکاري معرفی شدهاند. همچنین تحقیقات Veillette و همکاران در سال 2004 نشان داد که با وجود افزودن بیوساید به امولسیون فلزکاري باکتریهاي گرم منفی مانند سویههاي
سودوموناس توانایی تخریب پذیري امولسیونهاي فلزکاري را دارند 13) و .(14
یکی از دلایل مؤثر نبودن بیوساید درامولسیونهاي فلزکاري افزایش بارمیکروبی تاحد 1010 CFU/ml میباشد. در این شرایط امکان هیدرولیز وخنثی سازي بیوساید به وسیله میکروارگانیسمها وجود دارد. به همین دلیل تعیین آلودگی میکروبی با استفاده از بیوساید مناسب و ارزیابی منظم غلظت بیوساید اهمیت دارد. اکثر میکروارگانیسمهاي امولسیون فلزکاري در شرایط هوازي و کمی قلیایی و حرارت 20 تا 45 درجه سانتی گراد رشد میکنند. آلودگی زیاد میکروبی، میتواند نشان دهنده کم و یا نامناسب بودن فعالیت بیوساید باشد. زیرا در این شرایط به وسیله میکروارگانیسمها هیدرولیز و خنثی میگردد. براي تعیین آلودگی میکروبی، ارزیابی منظم غلظت بیوساید و همچنین مشخص بودن دفعات مورد استفاده آن اهمیت دارد .(15)
با توجه به قدرت تشکیل بیوفیلم توسط اکثر سویهها باید در زمان تعویض امولسیون فلزکاري، مخزن نگهداري، لولهها، پمپها و سایر قسمتهاي در ارتباط با امولسیون فلزکاري، لجن زدایی و توسط شویندهها و گندزداهاي مناسب کاملاً شستشو داده شوند .(5)
در واحد ریخـتهگري مس سرچشمه کرمـان از ترکیبی به نام امولسیون فلزکاري متعلق به شرکت Richard Appex
(HRL) استفاده میگردد. محتویات این ماده به صورت
انحصاري است و به همین دلیل هیچ گونه اطلاعات علمی و دقیقی در مورد چگونگی استفاده از آن در دسترس نیست و بدیهی است که به دلایل گفته شده نیز مورد پشتیبانی قرار نمی گیرد. مطالعات انجام شده نشان می دهد که در هنگام استفاده از امولسیون فلزکاري بایستی حتماً ویژگیهاي میکروبی و میزان بیوسایدهاي آن در رقت مورد استفاده مرتباً ارزیابی گردد. اما متأسفانه تاکنون، چنین پژوهشی به صورت اصولی و علمی انجام نشده است.
همچنین با توجه به اطلاعات به دست آمده از متخصصین مجتمع و مشاهدات حضوري، به دلیل کم بودن عمر استفاده از امولسیون در این سیستم، احتمال آلودگی میکروبی امولسیون فلزکاري مورد استفاده در واحد ریختهگري و تأثیر قابل توجه آن بر روي کارآیی محلول امولسیون فلزکاري وجود دارد. هدف از انجام این پژوهش، ارزیابی میزان بار میکروبی امولسیون فلزکاري واحد ریختهگري مس سرچشمه کرمان قبل و پس از تعویض امولسیون و تأثیر میکروارگانیسمهاي جدا شده بر روي کاهش کیفیت امولسیون و ارزیابی وجود بیوسایدها در آن با انجام تستهاي مقاومت زیستی است.
مواد و روشها
تمامی نمونهها از مخزن ذخیره امولسیون فلزکاري واحد ریختهگري پیوسته مس سرچشمه کرمان در مدت 9 ماه ازشهریور 1386 تا اردیبهشت 1387 با روش دورهاي منظم
(Grab sampling) در دو نوبت کاري قبل از شروع به کار دستگاه در ابتداي هفته و پس از اتمام کار دستگاه در پایان همان هفته جمع آوري شدند. براي جداسازي سویههاي میکروبی هوازي شامل باکتریهاي مزوفیل، ترموفیل، کپک و مخمرها، پس از تهیه رقتهاي متوالی درفسفات بافرسالین
(PBS) داراي 7/2 pH به ترتیب در محیطهاي پلیت کانت آگار، تریپتیکاز سوي براث، پتیتو دکستروز آگار و Y.G.M
(Yeast Glucose Agar) تمامی مربوط به شرکت مرك آلمان کشت داده شد. همچنین به منظور ارزیابی باکتریهاي
354
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 3، 1392
بیهوازي احیا کننده سولفات ( Sulphate Reducing (Bacteria =SRBs از روش بیشترین شمارش احتمالی
(Most Probable Number) در محیط پست گیت Post ) B (Gate B شرکت مرك آلمان و کشت در محیطهاي اختصاصی تأییدي و محیط دو فازي یاد شده داراي فاز مایع و جامد استفاده شد 2) و .(6
براي تفکیک توانایی میزان رشد میکروارگانیسمها در محیط کامل امولسیون فلزکاري (داراي روغن و الکل) و
محیط امولسیون فلزکاري داراي روغن و بدون الکل، از محیط کشت نمکی معدنی Mineral Salt =M.S.S) (Solution واجد دي هیدروژون پتاسیم فسفات 2)گرم درلیتر)، هیدورژن دي پتاسیم 5) گرم در لیتر )، فسفات سولفات آمونیوم 3) گرم در لیتر)، کلرید کلسیم 0/01) گرم در لیتر)، کلرید سدیم 0/1) گرم در لیتر)، سولفات آهن
0/01) گرم در لیتر)، سولفات منیزیم 0/2) گرم در لیتر) و
سولفات منگنز 0/002) گرم در لیتر) استفاده شد. محیط جامد امولسیون فلزکاري کامل نیز شامل محیط M.S.S
آگاردار واجد روغن خالص امولسیون فلزکاري استریل 1)
درصد) و ایزوپروپیلیک الکل 1) درصد) بود. همچنین براي ساخت محیط امولسیون فلزکاري بدون الکل به محیط
M.S.S آگاردار، روغن فلز کاري خالص افزوده شد.
کلونیهاي جدا شده به صورت نقطهاي (Spot culture) در محیطهاي یاد شده کشت داده شد و باکتریهاي مزوفیل در
30 درجه سانتی گراد، ترموفیلها در 44/5 درجه سانتی گراد و مخمرها و قارچها در 25 درجه سانتی گراد به مدت
3 تا 5 روز گرمخانه گذاري گردیدند.
تستهاي آمیزندگی (Emulsification) بر اساس روش پیشنهادي Francy در سال 1991 انجام گرفت .تستهاي آمیزندگی در محیط مایع M.S.S واجد 0/03 گرم عصاره مخمر و 0/03 گرم گلوگز انجام شد. براي انجام تستهاي آمیزندگی از هیدروکربنهاي متداول مشتق شده از نفت خام شامل نفت سفید، بنزین و گازوئیل استفاده گردید. تستهاي
آمیزندگی برروي تمامی کلونیهاي جداسازي شده انجام گرفت. هرکدام از کلونیها به شش لوله حاوي محیط
M.M.S واجد عصاره مخمر وگلوکز افزوده و به مدت 24
ساعت در دماي 30 درجه سانتی گراد گرمخانه گذاري شدند. سپس به دو لوله اول 0/5 میلی لیتر نفت سفید استریل شده با پالایه غشایی (membrane filter)، 0/5
میلی لیتر بنزین استریل به دو لوله دوم و 0/5 میلی لیتر گازوئیل استریل به دو لوله سوم افزوده شد و پس از مخلوط کردن با دستگاه vortex در دماي 30 درجه سانتی گراد گرماگذاري شدند. درنهایت میزان آمیزندگی جدایهها از صفر تا چهار ثبت گردید 1) و .(4
به منظور تأیید توانایی تولید بیوسورفاکتانت، سویههاي میکربی داراي متوسط آمیزندگی بیش از 2/5 تا 4، براي اندازه گیري کشش سطحی انتخاب شدند و براي اندازهگیري کاهش کشش سطحی از دستگاه تنسیومتر
(Tensiometer-TDIC, LAUDA) استفاده شد. در این تست سویههاي انتخاب شده به یک ارلن حاوي 100میلی لیتر محیط M.M.S داراي 0/03 گرم عصاره مخمر و 0/03
گرم گلوکز تلقیح و به مدت سه روز در دماي 30 درجه سانتی گراد گرمخانه گذاري گردیدند. کشش سطحی براي هر کلونی به دو صورت بدون سانتریفیوژ و پس از سانتریفیوژ با دور 4500 rpm به مدت 15 دقیقه اندازه گیري و ثبت گردید 1) و .(4
به منظور ارزیابی تغییرات میکروبی برروي ساختار MWFs، کلونیهایی که اختلاف کشش سطحی بالاتر از 9
میلی نیوتن بر متر داشتند به محیطهاي MWF1 و MWF2
تلقیح و تأثیرشان بر روي امولسیون با دستگاه کروماتوگرافی مایع با فشار زیاد ( High Pressure Liquid (Chromatography=HPLC ساخت کشور ژاپن
(SHIMADZO 10 AVD) ارزیابی گردید. این تست در محلول آب نمک 8/5 گرم در لیتر (S) و دو نوع امولسیون فلزکاري انجام شد. امولسیون فلزکاري مطابق فرمول مورد
355
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 3، 1392
استفاده در واحد ریخته گري مس سرچشمه کرمان به صورت 1 درصد روغن فلز کاري MWFs) ایرانی و خارجی)، 1 درصد الکل ایزوپروپلیک و 98 درصد آب ساخته شد. سپس 1میلی لیتر از سوسپانسیون واجد باکتري
(1/5 × 108 cfu/ml) درون میکروتیوبهاي 1/5میلی لیتر ریخته و سه غلظت ( 10ppm و100و(1000 از بیوسایدهاي فنلی ]دوئیساید [( Dowicide1)، فرمالدئیدي
]ونساید (VancideTH) و تریس نیترو [(TrisNitro) و
گلوتارآلدئید (Glutaraldehyde) به هرکدام از لوله ها اضافه و در زمانهاي 15 و30 دقیقه در دماي 25 درجه گرما گذاري گردید. در مرحله بعد 100 میکرولیتر از هر نمونه درمحیط تریپتیک سوي آگار (TSA) شرکت مرك کشت و پس از 24ساعت گرمخانه گذاري در دماي 30 درجه شمارش کلونیها انجام شد . (12)
حداقل غلظت بازدارنده ( Minimum Inhibitory
(Concentration=MIC براي بهترین بیوساید درمرحله قبل براي جدایههاي غالب باکتریها به صورت جداگانه و مخلوط، در دو محیط امولسیون فلزکاري ایرانی (MWF1)،
امولسیون فلزکاري خارجی (MWF2)، محلول استریل تریپتیک سوي براث (TSB) شرکت مرك و محلول آب نمک اندازه گیري شد. سپس با بررسی کدورت لولهها و همچنین نتایج کشت بر روي محیط TSA حداقل غلظت بازدارنده (MIC) تعیین گردید .(11)
به منظور تأیید کارآیی بیوساید مؤثر بر روي باکتریهاي غالب جداسازي شده از HPLC استفاده شد. در ابتدا براي هر یک از باکتریهاي شناسایی شده به عنوان باکتریهاي مخرب و مخلوط آنها سوسپانسیونی معادل با استاندارد نیم مک فارلند (1/5 × 108 cfu/ml) تهیه شد. درمرحله بعد یک میلی لیتر از هر سوسپانسیون و بیوساید مؤثر شناسایی شده در مرحله قبل به 200 میلی لیتر محیط امولسیون فلزکاري استریل مشابه ترکیب مورد استفاده در واحد ریختهگري پیوسته مس سرچشمه (امولسیون ایرانی
وخارجی) اضافه شد و به مدت 2 هفته در حرارت 30
درجه سانتی گراد گرمخانه گذاري گردید.
تعیین هویت سویههاي میکربی با استفاده از آزمونهاي فنوتیپی و بیوشیمیایی شامل تریپل شوگر آیرون آگار
(TSI)، سیمون سیترات، سولفید /اندول/موتیلیتی (SIM)،
لیزین دکربوکسیلاز (LD)، اورنتین دکربوکسیلاز (OD)،
آرژنین دکربوکسیلاز (AD)، آلانین دآمیناز (ADA)،
اکسیدیتیو/فرمانتیتیو (OF) و تستهاي تخمیر کربوهیدراتها انجام شد 16) و .(17
نتایج
بهطور کلی در این پژوهش از مخزن امولسیون فلزکاري واحد ریخته گري، 66 باکتري مزوفیل (فراوانی 63/46
درصد)، 24 باکتري ترموفیل (فراوانی23/08درصد)
و14مخمر 13/46)درصد) به عنوان میکروارگانیسمهاي غالب در مدت 9 ماه جداسازي گردید. دو نوع محیط کشت داراي روغن و الکل (محیط کامل) و محیط فاقد الکل (داراي روغن) براي ارزیابی توانایی رشد تمام میکروارگانیسمهاي جداسازي شده استفاده شد. هیچ کدام از باکتریهاي ترموفیل و قارچهاي مورد بررسی توانایی رشد برروي محیطهاي یاد شده را نداشتند.
میکروارگانیسمهایی که قادر به استفاده از روغن به عنوان تنها منبع کربن بودند برروي محیط فاقد الکل و آنهایی که توانایی استفاده از الکل و یا روغن و الکل (به صورت توام) را داشتند، قادر به رشد در محیط کامل بودند. از بین جدایههاي باکتري و مخمر، 65 سویه 62/50)درصد) داراي رشد اندك و 39 سویه 37/50)درصد) رشد بالایی را داشتند. معیار ارزیابی میزان رشد در این مرحله، مقایسه کشت خطی باکتریها در پلیتهاي یاد شده با نمونههاي شاهد بود.
از مجموع میکروارگانیسمهاي مورد بررسی 17 سویه
16/35)درصد) که توانایی آمیزندگی مایع فلز کاري (بین
356
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 3، 1392
2/5 تا (4 را داشتند، براي اندازهگیري کشش سطحی انتخاب شدند. هیچ کدام از باکتریهاي ترموفیل، احیاکننده سولفات (SRBs) و قارچها توانایی آمیزندگی هیدروکربنهاي متداول نفتی را نداشتند. از بین 17 سویه مورد بررسی 15 سویه که بیش از 9 میلی نیوتن بر متر اختلاف کاهش کشش سطحی نسبت به محیط شاهد را داشتند، به منظور آنالیز تخریبپذیري زیستی انتخاب گردیدند. آنالیز HPLC و سپس تعیین هویت باکتریها با استفاده از جداول کتاب برگی ( Bergey's Manual of (Systematic Bacteriology نشان داد که سه سویه
Alcaligenes sp. (شکل (1، Acinetobacter lwoffi و Acinetobacter anitratus بیشترین اثر تخریبی را در امولسیون فلزکاري دارند .(17)
در مرحله بعد کارآیی 4 بیوساید از گروههاي مختلف بیوسایدهاي متداول مورد استفاده در امولسیون فلزکاري
شامل دو بیوساید فرمالدئیدي (ونساید و تریس نیترو)، یک بیوساید فنلی (دوئیساید) و گلوتارآلدئید برروي سه سویه غالب جدا شده به صورت جداگانه و مخلوط در دو محیط امولسیون فلزکاري (خارجی و ایرانی) و محلول آب نمک بررسی شد. نتایج نشان داد که از بین 4 بیوساید مورد بررسی درمحیط MWF1 (ایرانی) و MWF2 (خارجی)،
