دانلود مقاله روشهای بیوشیمی مطالعه سلول

word قابل ویرایش
107 صفحه
17700 تومان
177,000 ریال – خرید و دانلود

روشهای بیوشیمی مطالعه سلول

سیتوشیمی
با کمک روشهای سیتوشیمی می‌توان ساختمانهای شیمیایی اجزاء سلول را در وضعیت طبیعی ( In Situ ) آن شناخت دو راه را برای این منظور وجود دارد :
۱) استفاده از مواد شیمیایی که در اثر تماس با مواد دیگر درون سلول واکنشی ظاهر سازند که به کمک میکروسکوپ الکترونی قابل رؤیت است .
برای مطالعه با میکروسکوپ نوری بایستی این مواد شیمیایی رنگی باشند و برای مشاهده در میکروسکوپ الکترونی باید این مواد مانع حرکت الکترونها، یا باعث پراکندگی آنها گردند. (۱)

۲ ) امکان دوم استفاده از آنزیم‌هایی است که بطور اختصاصی موادی را تجزیه نمایند این مواد بعداً در سلول قابل رؤیت نیستند تعیین اینکه محصول یک واکنش جزئی از ساختمان سلول است یا خیر زمانی ممکن است که نتیجه واکنش سبب انباشتگی و تراکم ماده مورد جستجو گردد علاوه بر این واکنش باید طوری اختصاصی باشد که قضاوت قابل اعتمادی را ممکن سازد از طرف دیگر اجزاء سلولی به قدر کفایت طبیعی باقی بمانند تا مقایسه و قضاوت را ممکن سازند (مثلاً تراکم موادی در میتوکندری زمانی قابل اثبات است که ساختمان میتوکندری به شکل طبیعی آن موجود باشد با دو مثال مطالب فوق روشن می‌گردد :

در نقاط مختلف سلول فسفاتاز یعنی آنزیمی که هیدر

ولیز فسفات را تسریع می‌نماید وجود دارد اگر یک سلول ثابت شده با آلدئید را (آلدئید فعالیت آنزیمی را از بین نمی‌برد) با مخلوطی از فسفات محلول و نیترات سرب مجاور کنیم (قطره‌ای روی بافت قرار می‌گیرد) در نقاطی که آنزیم موجود است فسفات هیدرولیز شده و تولید اسید فسفریک می‌نماید که خود در اثر ترکیب با نیترات سرب فسفات سرب به وجود می‌آورد .
این ترکیب غیر قابل حل در آب بوده و تولید رسوبی می‌نماید که به شدت الکترونها را متفرق می‌کند به این ترتیب تمام نقاطی که دارای فسفاتاز هستند در سلول مشخص می‌گردند .

دیواره غالب سلولهای گیاهی دارای سلولز می‌باشد که با املاح فلزات سنگین کنتر است ندارد اگر آنزیم سلولاز را روی سلول ثابت شده با آلدئید اثر دهیم سلولز به موادی که ملکولهای ریز قابل حل در آب تبدیل می‌گردند این عمل منجر به از بین رفتن کنتر است تقاطعی که قبلاً سلولز وجود داشت می‌گردد با این روش می‌توان پی به مقدار کمی سلولز در دیواره سلولزی و احتمالاً چگونگی سنتز آن پی برد . (۲)

اتورادیوگرافی ( AUTORADIOGRDHY ) :
ایزوتوپهای رادیواکتیو ایزوتوپهایی هستند که هسته آنها در اثر تشعشع پیوسته تحلیل می‌رود این گونه ایزوتوپها در سیتولوژی برای ردیابی مواد معینی در سلول به کار گرفته می‌شود با کمک منوساکاریدهای علامت‌گذاری شده با۱۴ Cمی‌توان بوسیله روشهای اتورادیوگرافی یا به طور مستقیم توسط اندازه‌گیری فعالیت تشعشعی اجزاء مختلف سلول سنتز پلی‌ساکاریدها را مشخص کرد روش اخیر با کمک دستگاه مخصوصی به نام سین‌سیلاسیون شمار (نور ساطع کردن و برق زدن = Scintilation ) انجام می‌گیرد .

در روش مستقیم اتورادیوگرافی می‌توان از میکروسکوپ نوری یا الکترونی استفاده کرد در هر دو مورد بافت بعد از دریافت ماده رادیو اکتیو ( خوراندن ـ تزریق ) ثابت آغشته و برش داده می‌شود مقاطع بعداً با لایه‌ای حساس یا فیلم پوشانده می‌شوند تشعشعات ماده رادیو اکتیو مثل اشعه نور صفحه فیلم یا ماده حساس دیگر را متأثر و فیلم پس از ظهور در محل سیاه شده مورد مطالعه قرار می‌گیرند شرط موفقیت دراتورادیوگرافی انتخاب ماده حساس برای پوشاندن مقاطع انتخاب زمان دقیق برای تأثیر اشعه و بالاخره ظاهر کردن مناسب ماده حساس یا فیلم می‌باشد معذالک نمی‌توان از این روش در هر موردی از سیتولوژی استفاده نمود اتورادیوگرافی بیش از هر روش دیگر به دقت و تجربه نیازمند است . (۲)

جداسازی اجزاء سلول :
برای انجام آزمایشات شیمی با اندازه‌گیری و مطالعه عمل اجزاء مختلفه یک سلول : لازم است که این اجزاء از بقیه قسمتها جدا گردند برای این منظور سلولها هموژن می‌شوند بعد محتویات سلولها با کمک اولترا سانتریفوژ به صورت بخشهای مستقلی که هر یک محتوی ساختمان خاصی از سلول هستند از هم جدا می‌گردند .
عمل هموژن کردن در سلولهائی که با دیواره سختی پوشیده نمی‌شوند از طریق شوک اسمزی با تأثیر امواج صوتی بالای Hkz 20 صورت می‌گیرد .

سلولهای بادیواره سخت بایستی در هموژنیزاتور با چاقو یا گلوله‌های شیشه‌ای ذرات کوارتز و نظایر آن ساییده شوند در هر حال این عمل نباید موجب آسیب و در نتیجه کاهش فعالیت اجزاء سلولهای گردد عمل سانتریفوژ کردن در دو مرحله انجام می‌گیرد :
۱ ) نوع ساده DiFFERENCIAL CENTIFU GATION
2 )‌جدا کردن به طریق هموژنی ( ISOPICNIC )
کروماتوگرافی ( CHROMATOGRAPHY ) :

با کمک روشهای کروماتوگرافی ملکولهای مختلف بر اساس ویژگیهای متفاوت خود نظیر ملکول‌ها ( فیلترژله‌ای ) حلالیت در دو فاز ( کروماتوگرافی تقسیمی ) و بالاخره خصوصیات جذبی ( کروماتوگرافی جذبی ) از یکدیگر جدا می‌گردند . (۳)
الکتروفورز ( ELECTROPHORESIS ) :
ملکولهای دارای بارالکتریکی نظیر اسیدهای آمینه و پروتئینها در یک میدان الکتریکی توجه به نقطه ایزوالکتریک خود با سرعتهای متفاوت مهاجرت می‌نماید این کیفیت را الکتروفورز می‌گویند پس در این روش ملکولهای دارای بار الکتریکی بر حسب سرعت خود مشخص از یکدیگر جدا می‌گردند عمل الکتروفورز می‌تواند در یک محلول بافر انجام می‌گیرد غالباً برای محلول بافر که نقش الکترولیت را دارند ناقل سختی نظیر کاغذ لایه‌های نازک استات یازل پلی‌آکریل آمید ( Polyacrylamidgl ) انتخاب می‌گردد در اینجا ملکولها نه تنها به علت بار الکتریکی متفاوتشان بلکه بر حسب اندازه و شکل ملکول‌هایشان جدا می‌گردند هرچه وزن ملکولی بیشتر باشد حرکت ملکول کندتر است ساختمان فضائی ملکولها نیز در حرکتشان مؤثر است .
اساس کار به قرار زیر است :
ژل جدا کننده با ژل یک ثانویه باروزنه‌های درشت پوشیده می‌‌شود که روی آن محلول مورد آزمایش منتقل می‌گردد در میدان الکتریکی ملکولها در ژل ثانویه مهاجرت می‌نمایند و در مرز بین دو ژل در یک بخش نازک متمرکز می‌شوند در اینجا ملکولها در ژل جدا کننده ( اولیه ) بر طبق اندازه ملکولها و تحرک الکتروفورزی خود جدا می‌گردند بین ژل جدا کننده ( اولیه ) و ژل جمع کننده ( ثانویه )، دو عامل غیر هماهنگ PH و اندازه روزنه‌ها در دو ژل موجود می باشند . (۳)
فتومتری ( PHOTOMETRIE ) :
عده‌ای از اجزاء سلولی این خاصیت را دارند که امواج نوری با طول موجهای معین را جذب نمایند و با این کیفیت می‌توان این اجزاء را از نظر کیفی و کمی مورد مطالعه قرار داد . (۳)

متد کشت سلول :
تکنیک کشت سلول یا بافت در بیوشیمی بیولوژی ملکولی فیزیولوژی سلولی ژنتیک، جنین شناسی، انگل شناسی، بافت شناسی و غیره به کار می‌رود معمولی‌ترین سلولهایی که کشت داده می‌شوند سلولهای باکتریها و سلولهای بافتهای پستانداران هستند برای کشت سلول باید اول محیط کشت مناسب آن نوع سلول خاص تهیه گردد که در آن عوامل منبع انرژی سلولها، امواج، عوامل رشد، اسیدیته ( PH ) مناسب و حرارت مورد توجه قرار می‌گیرند .

محیط کشت سلولهای پستانداران پیچیده‌تر از محیط کشت مورد نیاز سلولهائی نظیر باکتریهاست در ابتدای کار کشت سلول این‌طور معمول بود که مخلوطی از سرم و عصاره جنین جوجه، به عنوان محیط کشت بکار برده می‌شدند در سلولهای اخیر محیط کشت ترکیبی درست شده که محتوی ترکیبات متعددی است بعنوان مثال می‌توان محیط کشت ترکیبی از آب، املاح و مواد معدنی و محتوی متابولیتهای زیادی باشد حتی امروزه علیرغم ترکیبات پیچیده محیطهای کشت ترکیبی ب

ه طور معمول لازم است که از سرم جنین یا سرم اسب و غیره بعنوان تکمیل کننده محیط کشت که باعث رشد سلول شود استفاده نمایند ساده‌ترین تکنیک برای مطالعه رشد سلولهای پرندگان و پستانداران متد برداشت بافت است قطعه کوچکی از بافت را روی لاملی که با قطره‌ای از پلاسمای جوجه و محیط کشت پوشیده است قرار می‌دهند پلاسما سخت شده و منعقد می‌گردد لامل بر روی یک لام گرد برگدانده می‌شود به طوریکه بافت و پلاسما در سطح زیرین قرار گیرند اطراف لامل توسط پارافین مذاب با قلم‌مو کاملاً مسدود و کشت در محیط با حرارت مناسب نگهداری می‌شود

.
کلیه عملیات کشت سلول از قبیل تهیه محیط کشت و وسائل جراحی و محل نگهداری بافت باید استریل شوند علاوه بر روش فوق روشهای دیگری از کشت بافت و سلول وجود دارند که طی آن سلولها را می‌توان در بطری و یا در ظرف پتری و غیره بر حسب نوع تجزیه کشت داد . (۴)

طرز قرار گرفتن بافت و محیط کشت با استفاد ه از لام مخصوص
بیولوژی سلولی و بیولوژی ملکولی

فصل دوم :

«میکرو مور فولوژی سلول »

در این قسمت به مطالعه ساختمان کلی و میکروسکوپی یاخته‌های تغییر نیافته می‌پردازیم مطالعه ساختمان شکلهای تغییر یافته سلول بعداً مورد بحث قرار می‌گیرد .
بخش اول مربوط به سلول جنینی ( مریستمی ) بعد سلول جانوری تغییر یافته واختصاصات آن وبالاخره ساختمان باکتریها و سیانو فسیه‌ها یعنی نمونه‌های پروکاریوت مطالعه خواهند ( Prokaryotes ) البته باید توجه داشت که این گروه از سلولها مثل یوکاریوتها ( Eucytes ) شامل بخش شبه هسته یا به اصطلاح نوکلئوتید (Nucleoid ) پلاسما و دیواره می‌باشند .

در سلولهای گیاهی دیواره سلولی گاه‌گاه بوسیله کانالهائی که همان پلاسمودسماستا ( Plasmodesmata ) هستند قطع می‌گردد در داخل غشاء سیتو پلاسم و در مرکز آن هسته قرار گرفته که در آن کروماتین و هستک ( نوکلئوس ) جای دارند هسته با شبکه تور مانندی از جنس غشاء که در تمام سلول کشیده شده و آندوپلاسمیک رتیکولوم ( Endoplasmic Reticum ) خوانده می‌شود احاطه می‌گردد .
این غشاء‌ها بعد از برش به شکل دو خط باریک در سلول جلب توجه می‌کنند علاوه بر اینها

ارگانلهای دیگر مانند میتوکندریها، پلاستیدها، سیتوزومها، دیکتیوزومها ( مجموع آنها دستگاه گلژی را می‌سازند ) ریبوزومها ( قسمتی از ER دانه‌دار ) واکوئلها و بالاخره اجزاء ذخیره‌ای نظیر کریستال پروتئین قطرات چربی در آن دیده می‌شوند دیکیتوزومها، ریبوزومها و شبکه آندوپلاسمی درون هیالوپلاسم ( بخش پلاسمای فاقد اندامک ) قرار دارند .
به استثنای پلاستیدها که در گیاهان سبز به وجود می‌آیند بقیه اجزاء درون سلول در قارچها و در سلولهای جانوری ( البته با تفاوتهائی ) هم وجود دارند واکوئلهای بزرگی که در سلولهای گیاهی وجود دارند پلاسمودسمها و تغییرات دیواره سلولزی از اختصاصات سلولهای گیاهی می‌باشند برعکس سانتریولها در سلولهای گیاهان عالی دیده نمی‌شوند ولی در تمام سلولهای جانوری همچنین در پروتوفیت‌های(Protophytes) دنیای گیاهان وجود دارند و در ساختن دوکها و سیستم حرکت مژه و تاژک ظاهر می‌گردند .(۳)
ساختمان ظریف سلول یوکاریوت
غشاء سیتوپلاسمی ( Unit Membrane ) :
سلول زنده خودش را در مقابل محیط به وسیله غشایی محافظت نموده و قادر است با کمک آن ترکیب محیط داخلی خویش را برای اعمال متابولیسمی مساعد نموده و این ترکیب را نیز حفظ نماید .
این غشاء با ضخامتی در حدود ۵ تا ۱۰ نانومتر در میکروسکوپ الکترونی سه لایه‌ای به نظر می‌رسد و با کیفیت ذکر شده سبب می‌گردد که مثلاً غلظت پتاسیم درون سلول در مقایسه با سطح خارجی غشاء اختلافی برابر ۱۰۳ نشان دهد در حالیکه برخی از مواد جز به مقدار ناچیز در سلول وارد نمی‌گردند حتی اگر به مقدار فراوان در اختیار سلول قرار گیرند

.
بنابر این وظیفه غشاء سلولی کنترل تبادل آزاد مواد و همچنین عضوی از انتقال مواد است که با کمک آن موادی حتی در جهت عکس کیفیت انتشار وارد سیتوپلاسم و یا از پلاسما به طرف خارج سلول منتقل می‌گردند .
به همین جهت ساختمان شیمیائی و آنزیمی و نحوه عمل آن برای تحقیقات تراوائی و انتقال اهمیت بسزائی دارد .
غشاء بیولوژیکی در مقابل انتشار مواد لیپوفیل مقاومتی

نشان نمی‌دهد حتی ملکولهای درشت از این دسته مواد می‌توانند به راحتی از آن بگذرند در حالیکه عبور ملکولهای هیدروفیل بستگی به اندازه آنها دارد .
هرچه ملکول هیدروفیل کوچکتر باشد عبور آن راحت‌تر انجام می‌گیرد ( تأثیر اوالترافیلتری غشاء ) مثال شناخته شده‌ای که ویژگیهای متفاوت غشاء‌های بیولوژیکی را در رابطه با قابلیت تروائی غشاهای زیستی نشان می‌دهد تله‌یونهای قرمز خنثی است قرمز خنثی ملکولهای لیپوفیل درشتی دارد که از غشاء بدون مانع می‌گذرند و وارد واکوئل می‌گردند در محتوی اسیدی واکوئل ملکولهای قرمز خنثی یونیزه شده و تولید یونهای هیدروفیل می‌نمایند که نمی‌توانند از غشاء عبور کنند یعنی از واکوئل نمی‌توانند مجدداً خارج گردند و با ورود بیشتر قرمز خنثی به واکوئل و تجزیه آن مقدارش در واکوئل پیوسته افزایش می‌یابد خصوصیات دینامیک غشاء سلول که پیوسته در حال ترمیم است با ساختمان متغیرغشاء واکنشهای انتقال مواد از غشاء سلولی قابل تطبیق است. (۴)
در کنار پلاسمای زمینه ( Hyaloplasma ) این ساختمان مهمترین بخش هر سلول است غشاء تمام پروتوپلاسما را به فضاهائی تقسیم می‌نمایند که در آنها واکنش‌های مختلف در حال انجام هستند مثل هسته، پلاستید‌ها میتوکندریها، دیکتیوزومها، لیزوزمها و غیره . تمام این اجزاء بوسیله غشائی از جنس و ساختمان مشترکی شبیه غشاء سلول احاطه می‌گردند . ( Unit Membrane ) و همین کیفیت انجام واکنشهای کاملاً متضادی را درون سلول در کنار همدیگر ممکن می‌سازد علاوه بر اینها تعداد زیادی آنزیم پیوسته به غشاء فعالیت کنند که اساس ساختمانی عده زیادی از واکنشهای بیوشیمیائی را به وجود می‌آورند غشاهای بیولوژیکی با این خصوصیات قابل مقایسه با غشا‌های مصنوعی که غالباً برای مطالعه مکانیسم انتقال و کیفیت تراوائی غشاء مورد آزمایش قرار می‌گیرند نیستند این غشاء با میکروسکوپ نوری قابل رؤیت نیست با وجود این، وجود آنها مدتها قبل از اختراع میکروسکوپ الکترونی مسلم بوده است .
با متدهای غیر مستقیم توانسته‌اند به ساختمان تقریباً دقیق غشاء پی ببرند اواخر قرن گذشته بعد از آزمایشهای فراوان روی تراوائی غشاء‌ها به این نتیجه رسیدند که بخش اعظم غشاء‌های بیولوژیکی باسیت از لیپید درست شده باشد چون که مواد محلول در چربی به مراتب بهتر از غش

اء می‌گذرند تا مواد محلول در آب. ملکولهای چربیهای ساختمانی قابلیت تجمع و ایجاد ساختمانهای صفحه مانند را دارند از بین چربیهای ساختمانی فسفولیپیدها و گیلیکولیپیدها از اهمیت بیشتری برخوردارند این ملکولها از گلیسرین اسیدهای چرب و اسید فسفریک در گیلیکولیپیدهد قند به وجود آمده‌اند از سه گروه OH مربوط به گلیسرین در فسفولیپید دو گروه OH با اسیدهای چرب و سومی

با اسید فسفریک پیوند می‌خورد که آخری بخش قطبی ملکول(آب دوست ـ Hydrophyle) را می‌سازد در حالیکه زنجیرهای هیدروکربور اسیدهای چرب، بخش غیر قطبی ( Hydrophobe ) آن را تشکیل می‌دهند و به این ترتیب از چربیهای ذخیره‌ای که تجمع توده‌ مانندی به وجود می‌آورند ( Plasmoqlobuli = قطرات چربی = Oleusome ) مشخص می‌گردند و در نتیجه این کیفیت سطح فعال به وجود آمده توسط چربیهای ساختمانی زیاد و در نزد چربیهای ذخیره‌ای غیر قطبی اندک خواهد بود .

این فقط قسمتی از متن مقاله است . جهت دریافت کل متن مقاله ، لطفا آن را خریداری نمایید
word قابل ویرایش - قیمت 17700 تومان در 107 صفحه
177,000 ریال – خرید و دانلود
سایر مقالات موجود در این موضوع
دیدگاه خود را مطرح فرمایید . وظیفه ماست که به سوالات شما پاسخ دهیم

پاسخ دیدگاه شما ایمیل خواهد شد