کارآیی فن‌آوری داس - الایزا در بهینه‌سازی مبارزه شیمیایی با بیماری بلاچ برگی گندم ناشی از Septoria tritici

بخشی از مقاله

چكيده
پيش‌آگاهي از وقوع بيماري بلاچ برگي گندم ناشي از Septoria tritici در تنظيم و طراحي دقيق مبارزه شيميايي بسيار حائز اهميت است. يكي از روشهاي شناسايي اين بيماري پيش از بروز علايم، استفاده از فن‌آوري ايمني‌سنجي است. در اين تحقيق اهميت بهره‌گيري از اين فن‌آوري در تعيين نوع، مقدار مصرف قارچكش و زمان سمپاشي مورد بررسي قرار گرفته است. براي اين منظور در 44 ظرف كاشت، گندم رقم روشن كاشته شد. گياهچه‌ها در مرحله 12 روزگي با سوسپانسيوني از اسپوريدي‌هاي قارچ مايه زني شدند. 20 ظرف كاشت پيش از بروز علايم بيماري و 20 ظرف ديگر پس از بروز آن با سه ميزان 2، 1 و 5/0 درهزار از قارچكش‌هاي پروپيكونازول و سايپروكونازول با سه تكرار سمپاشي شدند. چهار ظرف كاشت باقيمانده در

هر دسته نيز بعنوان شاهد با آب معمولي تيمار گرديد. اين طرح بصورت طرح فاكتوريل و در قالب طرح كاملاً تصادفي به اجرا درآمد. چگالي نوري نمونه‌هاي برگي پس از عصاره گيري و انجام آزمون الايزا تعيين و به مقادير واحدهاي پادگني قارچ تبديل شده و تاثير هر يك از تيمارها بر اين مقادير مورد مقايسه قرار گرفت. نتايج نشان داد كه بين مقادير درصد كاهش

واحدهاي پادگني در صورت اعمال سمپاشي پيش و پس از بروز علايم اختلاف معني داري وجود دارد. همچنين درصورت استفاده از قارچكش پروپيكونازول و سايپروكونازول با پيش‌آگاهي بيماري مي‌توان ميزان سمپاشي و در نتيجه هزينه سمپاشي با هر دو قارچكش را تا 4 برابر كاهش داد. اختلاف معني داري بين درصد كاهش واحدهاي پادگني در دو قارچكش سايپروكونازول و پروپيكونازول ديده نشد. استفاده از اين فن‌آوري علاوه بر تعيين زمان دقيق اعمال تيمارها، به كاهش قابل توجه ميزان سمپاشي با قارچكش‌ها و تأثير هرچه بيشتر آنها خواهد انجاميد.

كلمات كليدي : بلاچ برگي گندم، Septoria tritici، مبارزه شيميايي، داس الايزا، پيش آگاهي، پروپيكونازول، سايپروكونازول، تشخيص پيش از بروز علايم
مقدمه
يكي از تهديدهاي عمده گندم‌كاري در كشور، شيوع و گسترش فزاينده بيماري بلاچ برگي گندم ناشي از S. tritici است (1و2). دلايل عمده افزايش اين بيماري، رواج كاشت ارقام گندم مقاوم به زنگها و سفيدك پودري ولي حساس به بيماري‌هاي سپتوريايي، از بين نبردن بقاياي گياهي، افزايش مصرف كودهاي ازته و مقاومت عوامل بيماريزا به قارچكش‌ها عنوان شده است (7و8و10). يكي از جنبه‌هاي حفاظت گياهان از آسيب عوامل بيماريزا، پيش‌آگاهي و تشخيص آلودگي و عامل بيماريزا پيش از بروز علايم است. اينكار، درواقع به تصميم‌گيري در انتخاب نوع قارچكش، زمان و تعداد سمپاشي‌ها كمك خواهد نمود. بعبارت ديگر، استفاده از اين روش كه جهت سنجش آستانة بيماري انجام مي‌گيرد، در راستاي كاربرد بهينة قارچكش ها براساس مديريت تلفيقي آفات از اهميت زيادي برخوردار مي‌باشد (6).

علي‌رغم وجود گندم‌هايي حامل ژن‌هاي مقاومت به بيماري سپتوريوز برگي، هنوز كنترل اين بيماري با استفاده از قارچكش‌ها انجام مي‌شود و در اين راستا، قارچكش‌هاي تريازولي عملاً نتايج موفقيت‌آميزي درپي‌داشته‌اند. انتخاب نوع و مقدار سم بكار گرفته شده در هر مزرعه برحسب شرايط اقليمي، رقم و مرحله رشدي محصول متفاوت خواهد بود (10). از نقطه نظر همه‌گيري‌شناسي بيماري، مرحله‌اي از رشد ميزبان كه تعيين كنندة اِعمال تيمارهاي معالجه‌اي عليه اين بيماري است، زمان مشخصي نداشته و از اين لحاظ اقدام ناآگاهانه به

سمپاشي نيز موفقيت اتفاقي و ناپايدار خواهد داشت (7). در مراحل اوليه آلوده شدن گياه، علايم دقيقي حاكي از بروز اين بيماري در گياه قابل رؤيت نيست. از طرفي، تأثير حتي مؤثرترين سم تريازولي نيز به دورة گسترش هيف S. tritici در بافت ميزبان (14 الي 21 روز) محدود مي‌شود. بعبارت ديگر پس از پيدايش پيكنيد‌ها در سطح برگ هيچ‌ يك از سموم تريازولي موجود تأثير چنداني در كنترل بيماري ندارد (9). ازاينرو، شناسايي بيماري سپتوريوز در گياه پيش از بروز علايم و پيدايش پيكنيدها اهميت بسياري دارد، چرا كه به انتخاب زمان دقيق سمپاشي، نوع و مقدار مناسب قارچكش مورد استفاده، كمك نموده و كنترل بهتر بيماري را درپي‌خواهد داشت (9).

يكي از رايج‌ترين فن‌آوري‌ها در تشخيص اين بيماري پيش از بروز علايم، روش داس‌الايزا1 مي‌باشد كه اساس كار آن اتصال آنتي‌بادي ويژه به آنتي‌ژن خود بصورت پايدار و كاملاً اختصاصي است (12،14). اين روش اكثراً در تشخيص بيماري‌هايي كه دورة نهفتگي طولاني‌تري دارند، بكار مي‌رود (3،14). با استفاده از اين روش، عامل بيماري حتي در هنگاميكه اولين سلولهاي آن شروع به رخنه در گياه مي‌كنند، قابل شناسايي و سنجش است. در اين روش از پادتن‌هاي فوق العاده اختصاصي استفاده مي‌شود كه محلهاي پروتئين خارج سلولي عامل بيماريزا را شناسايي مي‌كنند. واكنش بين پادگن و پادتن بسيارحساس و اختصاصي بوده و نتيجه آن به رقم و مرحلة رشدي ميزبان، محل قرارگيري و سن برگ، سمپاشي‌هاي قبلي و شرايط محيطي بستگي ندارد (12).

براي نخستين بار در سال 1988 شركت كشاورزي سيبا1 اقدام به توليد پادتن براي S. tritici و Stagonospora nodorum نموده و آن را ساعت سپتورياي2 ناميد (3 و12). در سال 1989 شركت نوارتيس، برنامه پيش آگاهي سپتوتست3 را بعنوان ابزاري پيشرفته و مدرن جهت شناسايي دقيق بيماريهاي سپتوريايي در گندم طراحي و ارائه نمود كه در حال حاضر در

كشورهايي نظير انگلستان، فرانسه، آلمان، سوئد و ايالات متحده رواج يافته است. همچنين سيستم پيش‌آگاهي ديگري در فرانسه بنام پرسپت4 نيز به همين منظور بوجود آمده است (3). شركتهاي توليد كنندة مواد شيميايي كشاورزي مثل سيبا، نوارتيس5 و دوپان6 نيز فعاليتهاي گسترده‌اي را درخصوص تشخيص مولكولي بيماريهاي مهم ازجمله بيماري سپتوريوز گندم آغاز نموده‌اند (5و6). هدف از اين آزمايش ارزيابي روش ايمني سنجي جهت استفاده بهينه از آفتكش‌هاي پروپيكونازول و سايپروكونازول در مبارزه با بلاچ برگي گندم مي‌باشد.

مواد و روش ها
اين تحقيق در گلخانه تحقيقاتي دانشگاه فردوسي مشهد و در سال 1379 انجام شد. آزمايش در قالب طرح فاكتوريل 2×2×4 با سه تكرار و طرح پاية كاملاً تصادفي در شرايط گلخانه به اجرا درآمد. در 44 ظرف كاشت چوبي به ابعاد تقريبي 25 × 50 و عمق 15 سانتيمتر محتوي نسبت مساوي از خاك بكر و كود حيواني، بذر گندم رقم روشن در دو رديف به فاصلة 15

سانتيمتر از هم و در هر رديف تعداد 10 بذر در فواصل 5 سانتيمتري بدون ضدعفوني كاشته شدند. جدايه قارچي F17 از مزارع گندم اطراف شهرستان فردوس از برگهاي مبتلا به بلاچ برگي گندم جداسازي و S. tritici تشخيص داده شد (10). ماية آلودگي قارچ از محيط كشت مايع سوكروز - مخمر (سوكروز 10 گرم، عصاره مخمر10 گرم و آب مقطر1000 ميلي ليتر) كه بمدت 8 روز در دماي 20 درجة سانتيگراد روي دستگاه تكاندهنده دوّار قرار داده شده بود، بدست آمد. سوسپانسيوني به غلظت 106 اسپوريدي در هر ميلي ليتر كه با استفاده از يك

لام گلبول شمار تنظيم شده بود، تهيه گرديد و به ازاي هر ليتر از اين سوسپانسيون يك ميلي ليتر ماده كاهنده كشش سطحي توين20 (‏Tween20) اضافه گرديد. گياهچه‌ها در مرحله 12 روزگي با كشيدن پنبة استريل آغشته به سوسپانسيون اسپوريدي بر برگها مايه زني شدند. گياهان پس از 3 روز نگهداري در زير يك پوشش پلاستيكي، در شرايط دمايي 3±22 درجه سانتيگراد با برداشتن پوشش‌ها نگهداري شدند.

بسترهاي كاشت بدو دسته 22 تايي تقسيم و دسته اول 10 روز پس از مايه‌زني و پيش از بروز علايم بيماري و دسته ديگر پس از بروز علايم بيماري و بمحض پيدايش پيكنيدها با سه ميزان 2، 1 و 5/0 در هزار از سموم پروپيكونازول (Tilt®,250 EC, novartis) و سايپركونازل (Alto®, 250 EC, novartis) در سه تكرار با مه‌پاش دستي سمپاشي شدند. چهار ظرف كاشت باقيمانده در هر دسته نيز بعنوان شاهد با آب معمولي تيمار شدند.

دو عدد كيت كامل تشخيصي S. tritici با امكان انجام 176 آزمون از شركت ال. اي. سي – بيوتست1 فرانسه خريداري گرديد. نمونه برداري‌ها در هر دسته، پس از مايه زني و پيش از سمپاشي بطور يك در ميان، از برگهاي دوم و سوم رديف كاشت و يك هفته پس از اِعمال سمپاشي‌ها از برگهاي سوم و دوم انجام شد. بدين‌ترتيب درصورتيكه برگ دوم يك گياه براي آزمون اول انتخاب مي‌شد، برگ سوم آن نيز براي آزمون دوم مورد استفاده قرار گرفت و برعكس. آزمون الايزا در دو مقطع زماني مختلف براي نمونه‌هاي دسته اول با كيت شماره 1 و

دسته دوم با كيت شماره 2 انجام شد. كيت ‌تشخيصي سپتوتست اختصاصاً براي تشخيص S. tritici طراحي شده و عملكرد آن بسيار سريع و حساس مي‌باشد. اين كيت شامل 96 چاهك در 12 ستون (1 تا 12) و 8 رديف (A تا H) مي‌باشد. چاهكهاي ستون 1 شامل شاهدهاي استاندارد مثبت و منفي مي‌باشند. در اين چاهكها مقادير پادگني معيني در پيوند با پادتن قرار دارند و شاهدي براي اطمينان از سلامت كيت و نيز وسيله‌اي براي ارزيابي آزمون نمونه‌ها مي‌باشد (11).

نمونه‌هاي برگي جمع‌آوري شده از هر يك از بسترهاي كاشت به قطعات كوچكي تقسيم و هر كدام بطور جداگانه بكمك يك هاون چيني تميز و همراه با بافر استخراج نمونه (1 ميلي ليتر بافر به ازاي هر گرم نمونه برگي) عصاره گيري شد (11). 100 ميكروليتر از هر عصاره‌ پس از عبور دادن از پارچه ململ دو لايه، به كمك يك ميكروپيپت تك كاناله با دو تكرار در چاهكهاي ميكروپليت ريخته شـده و ميكروپليت به مدت 15 دقيقـه در دماي اطـاق روي يـك شيكر دوراني با سرعت 250 دور در دقيقه قرار داده شد. پس از اين مرحله پوشش پلاستيكي چاهكهاي ستون 1 يعني شاهدهاي استاندارد مثبت و منفي برداشته شده و محتويات كليه چاهكها تخليه و هر چاهك چهار بار با 400 ميكروليتر از بافر شستشو شسته شد (11). با استفاده از يك ميكروپيپت 8 كاناله 100 ميكروليتر كانجوگيت1 (پيوندي از پادتن و آنزيم نشاندارشده) به هر چاهك اضافه شد. مراحل تكان و شستشو تكرار و 100 ميكروليتر محلول بستره به هر چاهك اضافه شد (11). ميكروپليت بمدت 10 دقيقه در دماي اطاق و در تاريكي با همان دور روي شيكر قرار داده شد و بلافاصله مقادير چگالي نوري هر يك از چاهكها با استفاده از دستگاه الايزا – خوان2 در طول موج620 نانومتر خوانده شد.

منحني تنظيم جذب نوري3 كيت با يافتن نقاط متناظر مقادير چگالي نوري4 و واحدهاي پادگني5 چاهكهاي ستون 1 ترسيم شد. مقادير واحدهاي پادگني چاهكهاي ستون 1 در دفترچه راهنماي كيت بصورت دو به دو بترتيب 192، 64، 21 و صفر واحد پادگني در هر ميلي‌ليتر ذكر شده است (11). جهت ارزيابي سطح آلودگي نمونه‌ها به S. tritici لازم بود تا مقادير چگالي نوري هر چاهك به مقادير واحدهاي پادگني تبديل شود. براي اين منظور پس از رسم منحني تنظيم جذب نوري هر كيت و با بدست آوردن معادله سه پاره خط منحني، مقدار چگالي نوري

در معادله مربوط قرار داده شد و مقادير واحدهاي پادگني هر چاهك محاسبه گرديد. سپس درصد كاهش مقادير واحدهاي پادگني از حالت قبل از سمپاشي به پس از آن براي تك تك تكرارها با فرمول ابداعي مقابل محاسبه گرديد ((A/Á ) - 1)100= R(%) كه در آن A مقدار واحدهاي پادگني پس از سم پاشي، Á مقدار واحدهاي پادگني پيش از سمپاشي وR درصد كاهش واحدهاي پادگني مي‌باشد. پس از محاسبه درصد كاهش واحدهاي پادگني تجزيه داده‌ها و مقايسة ميانگين هر يك از تيمارها با استفاده از نرم افزار MSTATC و با آزمون دانكن در سطح 5 درصد انجام شد.
نتايج و بحث
بررسي چاهكهاي شاهد استاندارد كيت نشان داد كه در سه نوع چاهكِ استاندارد مثبت بالا، متوسط و پايين يعني بترتيب چاهكهاي A1,B1، C1,D1 وE1,F1 افزايش تدريجي رنـگ آبي بوضوح قابل مشاهده است. درعين‌حال در شاهد منفي يعني چاهكهاي G1,H1 چگالي نوري كمتر از 1/0 بوده و چاهكهاي مذكور بدون تغيير رنگ باقي ماندند. اين امر مؤيد صحت عملكرد كيت تشخيصي و بيانگر اطمينان از آزمون مي‌باشد. در برخي از ساير چاهكهاي حاوي عصاره نيز توليد رنگ آبي در مقايسه با شاهد منفي بيشتر محسوس بود. اين وضعيّت

نشانه آلوده بودن نمونه آزمايش‌شده به S. tritici بود. برعكس چاهكهايي با تغيير رنگ كمتر نسبت به شاهد منفي، فاقد آلودگي تلقّي شدند (11). مقايسة ميانگين درصد كاهش واحدهاي پادگني در دو حالت پيش و پس از بروز علايم نشان ‌داد كه اين دو اختلاف بسيار معني‌داري با هم دارند و اين به معني تأثير به مراتب بيشتر سمپاشي‌هايي است كه پيش از بروز علايم انجام شده است (نمودار 1). مقادير اندازه‌گيري شده واحدهاي پادگني پس از سمپاشي با سه ميزان 2 ، 1 و 5/0 در هزار سايپروكونازول و پروپيكونازول نيز حاكي از آن است كه با اعمال سمپاشي‌ها پس از بروز علايم، مقادير بمراتب بالاتري از واحدهاي پادگني در گياه، بدون تأثير باقي مي‌مانند (جدول 1). اين مقادير درواقع نشاندهندة كم‌تأثيرماندن قارچ

عامل بيماري در نمونه‌هاي گياهي از سموم مورد استفاده و امكان گسترش مجدد و از سرگرفته شدن آلودگي و در نتيجه از بين رفتن تأثير قارچكش بكاررفته مي‌باشد. بررسي مقادير كاهش واحدهاي پادگني پس از سمپاشي با سم پروپيكونازول پيش از بروز علايم بيانگر اين مسئله است كه در واقع مي‌توان ميزان مصرف سم را تا حد 1 در هزار كاهش داد، چراكه سمپاشي پيش از بروز علايم با ميزان 1 و 2 در هزار سم پروپيكونازول اختلاف معني داري را نشان نمي‌دهند. از طرف ديگر هر سه ميزان سمپاشي با شاهد اختلاف معني داري را

نشان مي‌دهند (نمودار 3). با اينحال با اِعمال سمپاشي با ميزان 5/0 درهزار، مقدار كاهش واحدهاي پادگني با مقادير 1 و 2 در هزار اختلاف معني داري داشته و از اينرو قابل توصيه نمي‌باشد. همچنين تأثير سمپاشي با ميزان 5/0 درهزار پروپيكونازول پيش از بروز علايم، با كاربرد 2 درهزار اين سم پس از بروز علايم اختلاف معني داري ندارد، بنابراين با كاربرد اين سم در زمان پيش از علايم مي‌توان ميزان سمپاشي را تا 4 برابر كاهش داد. ضمن اينكه مقايسه مقادير نهايي واحدهاي پادگني باقيمانده در گياه در اين دو حالت نيز كاربرد ميزان پايين‌تر در

زماني صحيح را بيش‌ازپيش تأكيد مي‌كند (نمودار 2). بااينحال، در مورد كاربرد ميزان 2 درهزار از سم پروپيكونازول در دو زمان اختلاف معني‌داري ديده نمي‌شود (نمودار 3) و ممكن است تداعي‌گر اين فكر باشد كه با كاربرد ميزان بالاتري از سم مي‌توان بيماري را در هر زمان بدون نياز به پيش‌آگاهي كنترل نمود، ولي با مراجعه به مقدار نهايي پادگني باقيماندة قارچ پس از سمپاشي در دو حالت مي‌توان دريافت كه ايندو اختلاف بسيار فاحشي با هم دارند (نمودار 2). بنابراين كاربرد قارچكش‌ها حتي با ميزاني بالا بايستي در زماني صحيح يعني پيش از بروز

علايم صورت گيرد. نتايج در مورد كاربرد قارچكش سايپروكونازول نيز نشان مي‌دهد كه كاربرد هر يك از سه ميزان سايپروكونازول پيش از علايم در كنترل بيماري تأثيري بسزا خواهد داشت (نمودار 4). تأثير اين سه ميزان اختلاف معني داري با نشان نمي‌دهد و لذا مي‌توان گفت كه درصورت تشخيص بيماري پيش از بروز علايم مي‌توان ميزان سمپاشي سايپروكونازول را تا يك چهارم كاهش داد. همچنين كاربرد ميزان 2 در هزار و يك در هزار سايپروكونازول پس از علايم با 5/0 در هزار پيش از علايم اختلاف معني داري ندارد. اما با توجه به كاهش فوق العادة ميزان و در نتيجه هزينه سمپاشي در حالت دوم، در واقع بهره‌گيري از ميزان پايين‌تر پيش از بروز علايم قابل توصيه مي‌باشد.

جدول 1 ) مقادير واحد پادگني قارچ قبل و پس از سمپاشي با مقادير مختلف

قارچكش‌هاي پروپيكونازول و سايپركونازول پيش و پس بروز علايم بيماري
پروپيكونازول سايپروكونازول شاهد
2 ‰ 1 ‰ 5/0‰ 2 ‰ 1 ‰ 5/0‰ صفر
حالت پيش از بروز علايم پيش از سمپاشي تكرار 1 6/12 9/13 13 9/14 6/10 5/7 1/10
تكرار 2 5/11 7/12 5/11 9/7 5/12 3/10 6/12

تكرار 3 3/13 9/10 8/11 5/16 6/13 8/11 7/9
ميانگين 5/12 5/12 1/12 1/13 2/12 8/13 8/10
پس از سمپاشي تكرار 1 6/2 6/3 6/6 4/0 7/2 1/2 2/17
تكرار 2 3/2 5/2 6 0 3/1 8/2 2/18

تكرار 3 3 1/3 8 7/1 4 3/3 9/20
ميانگين 6/2 1/3 9/6 7/0 7/2 7/2 8/18
حالت پس از بروز علايم پيش از سمپاشي تكرار 1 1/38 1/28 2/61 3/21 3/48 42 3/32

تكرار 2 5/26 3/37 5/37 42 3/51 5/20 6/30
تكرار 3 2/45 37 8/43 6/39 2/35 38 2/48
ميانگين 6/36 1/34 4/47 3/34 9/44 5/33 37
پس از سمپاشي تكرار 1 7/15 17 8/49 2/8 5/23 9/30 9/59
تكرار 2 6/11 1/18 6/34 5/12 6/16 22 8/63
تكرار 3 7/11 7/18 4/34 5/15 6/20 2/32 90
ميانگين 13 9/17 6/39 1/12 1/20 4/28 2/71

ا اين اوصاف مي توان گفت كه با پيش‌آگاهي اين بيماري مي‌توان ميزان سمپاشي را در هر دو سم تا چهار برابر كاهش داد. بااينحال، بايستي خاطر نشان ساخت كه تنها شناسايي عامل بيماري براي برنامه‌ريزي در جهت حفاظت گياهان، كافي نخواهد بود. جمع آوري اين اطلاعات به همراه داده‌هاي مربوط به آب‌وهوا مي‌تواند پيش زمينه‌اي براي پيش‌آگاهي‌ها و نيز ارزيابي خطرات بيماري فراهم آورد. همچنين، كميّت سنجي بيماري با استفاده از اين آزمون، اين امكان را فراهم خواهد نمود كه تأثير قارچكش مورد استفاده پس از سمپاشي مزرعه مورد ارزيابي قرار گيرد (3). فن‌آوري ويژه‌اي به نام فن‌آوري درمحل1 نيز وجود دارد كه در مزرعه قابل اجراست و ظرف چند دقيقه مي‌تواند انجام و پاسخ مستقيماً به زارع ابلاغ گردد

(5و13). مزاياي اين نوع تشخيص را مي‌توان ارائه راه‌حل‌هايي براي سلامت محيط زيست، جلب اعتماد كشاورزان و مديريّت امن‌تر و بهتر بيماري‌ و نيز كاهش فشارهاي مالي بر كشاورز خلاصه نمود كه با انتخاب صحيح فرآوردة سمي و ارزيابي تأثير آن ميسّر مي‌شود. بدين‌ترتيب با بهره‌گيري از اين فن‌آوري، ديگر مشكلات روش‌هاي تشخيص سنتي، هزينه‌بر و وقت‌گير، كه با جداسازي عامل بيماري انجام مي‌گيرد، وجود نخواهد داشت. اين روشها، مكمّل ساير روشهاي بررسي بيماري شامل مشاهدات و نيز الگوهاي رايانه‌اي توسعة بيماري مي‌باشد كه در اختيار كشاورزان قرار داده مي‌شود. تشخيص بيماريهاي گياهي بعنوان ابزاري براي بهينه‌سازي عملكرد محصول، اثبات تأثير يك فرآورده شيميايي و عملي ساختن مديريت تلفيقي آفات و نيز گامي در جهت كشاورزي صحيح و اصولي خواهد بود (4).