بخشی از مقاله
چکیده:
ویروس ایکس سیبزمینی - PVX - از جمله ویروسهاي بیمارگر در مزارع سیب زمینی کشور می باشد که میتواند از 10 تا 20 درصد و در صورت توام بودن با سایر ویروسها تا 80 درصد موجب خسارت و کاهش محصول گردد. مهمترین راه انتقال این ویروس از طریق غدههاي بذري سیب زمینی میباشد و لذا استفاده از غدههاي بذري سالم بعنوان پیشگیري، از مهمترین راه هاي کنترل این ویروس محسوب میشود. در این راستا استفاده از سیستمهاي تشخیصی براي ردیابی این ویروس در مزارع سیبزمینی بذري و آزمونهاي آزمایشگاهی مرتبط با صدور گواهی سلامت بذر از اهمیت کاربردي زیادي برخوردار است. در این پروژه یک جدایه ایرانی ویروس ایکس سیبزمینی PVX-H8 پس از شناسایی و تایید خلوص بیولوژیکی و عدم اختلاط با سایر ویروسها، در گیاه توتون تکثیر و خالصسازي شد.
با تزریق آموده خالص ویروس به خرگوش سفید آزمایشگاهی، آنتی بادي پلیکلنال اختصاصی علیه ویروس تولید گردیده و بخش ایمیونوگلوبولین جی - IgG - از سرم جداسازي شد. بخشی از IgG تولیدي با آنزیم آلکالین فسفاتاز کانجوگیت گردید. طی آزمونهاي بهینهسازي، بهترین غلظت براي آزمون الایزا تعیین شد. نتایج حاصله نشان داد که سیستم الایزا توسعه داده شده در این پروژه با دقت مشابه کیتهاي خارجی قادر به ردیابی ویروس PVX در گیاه سیبزمینی است. بومیسازي دانش فنی تولید این کیت، جلوگیري از خروج ارز و عدم وابستگی به واردات کیت ها و کاهش هزینه تمام شده تستهاي الایزا در روند تولید سیبزمینی بذري از جمله دستاوردهاي این پروژه است.
واژههاي کلیدي: سیبزمینی بذري، ویروس ایکس سیبزمینی، الایزا.
مقدمه:
سیبزمینی از جمله محصولات مهم کشاورزي بوده و داراي نقش مهمی در تامین نیاز غذایی کشور میباشد. در سال زراعی 1386 میزان تولید این محصول بیش از 4/5 میلیون تن در کشور برآورد شدهاست . - 4 - یکی از مهمترین عوامل موثر در این مورد علاوه بر اصلاح و انتخاب ارقام پرمحصول، کشت غدههاي بذري سالم است. بیماريهاي ویروسی یکی از عوامل مهم کاهش محصول سیبزمینی بوده و از مهمترین محدودیتها در افزایش عملکرد این محصول محسوب میشوند.بیماريهاي ویروسی متعددي از روي سیبزمینی در کشور گزارش شدهاند که ویروس ایکس سیبزمینی Potato virus X- - - PVX از جمله آنها است . - 11 - این ویروس با پیکره رشتهاي جزو جنس Potexvirus میباشد . - 8 - پروتیئن پوششی آن از زیرواحدهایی باندازة حدود 25 کیلودالتون و ژنوم آن از یک مولکول آر.ان.آي تکرشتهاي خطی رشته مثبت بطول حدود 6400 باز تشکیل شدهاست . - 10 -
این ویروس به تنهایی در گیاه سیبزمینی موجب بروز علایم موزائیک یا پیسک در برگها شده و گاهی بسته به نوع رقم سیب زمینی آلودگی به آن با علائم خاصی همراه نیست. میزان خسارت این ویروس تا 10 درصد و در صورت آلودگی توام با ویروسهاي دیگر مانند ویروس واي سیبزمینی تا 50 درصد گزارش شدهاست . - 9 - در برنامههاي تولید سیبزمینی بذري سالم در کشور بکمک تکنیکهاي کشت بافت گیاهی، گیاهچههاي سالم و عاري از ویروس از گیاهان مادري ارقام مورد نظر سیبزمینی تولید شده و طی مراحل ازدیاد درون شیشهاي تکثیر و سپس در گلخانههاي تحت کنترل و در سالهاي بعدي در مزارع تحت کنترل، کشت و ازدیاد میشوند.
در تمام مراحل انجام این فعالیتها، ضرورت دارد تا آلودگیهاي ویروسی در گیاه، از طریق روشهاي نمونهبرداري و بکمک سیستمهاي تشخیصی دقیق و سریع، مورد ارزیابی قرار گیرند 5 - و . - 6 تکنیک الایزا، از جمله روشهاي تشخیصی بسیار معمول میباشد که بطور گستردهاي در آزمونهاي ردیابیویروسهاي بیمارگر در سیبزمینی در دنیا بکار میرود. طبق استانداردهاي بینالمللی و نیز استاندارد ملی تولید سیبزمینی بذري ایران، گیاهچهها و نسلهاي اولیه تولید مینیتیوبر سیبزمینی به منظور مصرف بذري در داخل یا صادرات به کشورهاي منطقه میبایستی از طریق آزمون الایزا مورد ارزیابی و تایید سلامت قرار گیرند.
در حال حاضر کیتهاي تشخیصی الایزا جهت تشخیص بیماريهاي ویروسی سیبزمینی از جمله ویروس PVX از خارج از کشور وارد میشود. از جمله مهمترین اجزا این کیتها، مولکولهاي آنتیبادي و نیز آنتیباديهاي متصل به آنزیم میباشند. خرید این کیتها از خارج از کشور، علاوه بر صرف هزینه ارزي، موجب وابستگی فنی شده و نیز کیتهاي خارجی ممکن است آلودگیهاي ناشی از جدایههاي ایرانی ویروس را بخوبی و با دقت بالا، نتوانند ردیابی نمایند. در این تحقیق دانش فنی ساخت کیت تشخیصی الایزا براي ردیابی ویروس PVX در کشور بومی سازي شد و نتایج حاصل نشان داد که کیت ساخته شده در این تحقیق به خوبی کیتهاي مشابه خارجی قادر به ردیابی ویروس PVX می باشد.
مواد و روشها:
جدایه ویروس PVX مورد استفاده در این بررسی - PVX-H8 - از مزارع سیب زمینی همدان جداسازي و شناسایی شد. ضمن بازدید از مناطق عمده کشت سیب زمینی در استان همدان، از بوته هاي سیب زمینی با علائم مشخصه موزائیک ، پیسک و روگوز نمونه هاي برگی جمع آوري شد. این نمونهها با استفاده از آنتی سرمهاي رفرانس تجاري - شرکتبیوربا سوئیس - ، طی آزمون الایزا، از نظر آلودگی به ویروسهاي مهم شایع در سیب زمینی شامل , AMV , PLRV , PVA , PVS , PVM , PVY PVX, TSWV مورد بررسی قرار گرفتند. براساس نتایج حاصله، نمونههایی که داراي آلودگی فقط به PVX بودند، انتخاب و عصاره آنها روي گیاه توتون Nicotiana tabacum cv. White Burley مایه زنی مکانیکی شدند. سیستمیک شدن ویروس PVX در این گیاهان مجددا بکمک آزمون الایزا مورد بررسی و تایید قرار گرفت.
جهت تکثیر ویروس از گیاه N. tabacum cv. White Burley استفاده شد. این گیاهان در گلخانه عاري از حشرات ناقل ، پرورش داده شده و در مرحله 6-5 برگی به روش مکانیکی، مایه زنی گردیدند. براي خالص سازي ویروس ترجیحا از روش توصیفی توسط توماس و کانیوسکی - 2001 - استفاده شد . - 12 - به منظور بررسی خلوص ویروس خالص شده، منحنی جذب نور آن در طول موجهاي 200 تا 300 نانومتر بوسیله اسپکتروفتومتر مدل فارماسیا ال.کی.بی - آمریکا - اندازه گیري گردید. از خرگوش سفید آزمایشگاهی جهت تهیه آنتی سرم استفاده شد. تزریق به دو روش عضلانی و زیرجلدي در چهار نوبت و به فواصل 10 روز انجام گردید. در هر نوبت حداقل 1/5 میلی گرم از ویروس خالص پس از مخلوط شدن کامل با یک میلی لیتر روغن ادجوانت غیرکامل فروند تزریق شد.
ده روز پس از آخرین تزریق، از طریق رگ کنار گوش، خونگیري بعملآمده و پس از انعقاد خون ، سرم مربوطه جداسازي گردید. براي خالص سازي ایمیونوگلبولین جی - IgG - از روش رسوب IgG با محلول سولفات آمونیوم اشباع و کروماتوگرافی تبادل یونی روي ستون سلولزDEAE - دي اتیلن آمینو اتان - استفاده شد . - 7 - از فرکشنهاي IgG انتخاب شده، غلظت 1 mg/ml تهیه و در آزمون الایزا بکار رفت. نیم میلی لیتر از IgG خالص شده - با غلظت - 1 mg/ml در برابر 100 میلی لیتر بافر PBS به مدت یک ساعت در دماي 4 درجه سانتی گراد دیالیز گردید. به داخل کیسه دیالیز حاوي IgG ، مقدار 60 میکرولیتر از آنزیم آلکالین فسفاتاز اضافه شده و به مدت یک ساعت در 100 میلی لیتر بافر PBS حاوي 100 میکرولیتر گلوترآلدئید و سپس به مدت یک شب در مقابل بافر - PBS 1/2 - دیالیز شد . - 7 -
در مرحله بهینهسازي، آزمون الایزا به روش DAS-ELISA با استفاده از آنتیبادیهاي تهیه شده در این تحقیق و نیز آنتیبادي هاي تجاري تهیه شده از یک شرکت معتبر خارجی - بعنوان شاهد - استفاده گردید . - 3 - بشقابکهاي الایزا از نوع Microlon - ساخت Greiner آلمان - بودند. در این آزمونها از محلولهاي IgG و نیز IgG-Conj تهیه شده در این تحقیق - هر دو با غلظت - 1 mg/ml، رقتهاي 1:200، 1:500، 1:1000 و 1:2000 تهیه شده و بطور ضربدري استفاده شد. رقت آنتیباديخارجی بر اساس توصیه خود شرکت سازنده تهیه و بکار رفت. حجم هر واکنش الایزا 200 میکرولیتر بود.
برگهاي سیبزمینی رقم مارفونا آلوده به 3 - PVX هفته پس از مایه-زنی - در بافر فسفات 0/1 مولار با اسیدیته 7/2 - به نسبت 1 گرم بافت در 10 میلی لیتر بافر - عصارهگیري شده و از این عصاره رقتهاي 1:2، 1:4، 1:8 و 1:16 در بافر فسفات تهیه شد.از این عصارهها بعنوانآنتیژن در مراحل آزمون الایزا استفاده گردید. نتایج واکنش در فاصله 60 دقیقه پس از افزودن سوبسترا به چاهکها توسط دستگاه ELISA Reader - مدل - MultiScan-Finland اندازهگیري و ثبت شد. در مرحله مونتاژ، اجزا تشکیل دهنده کیت الایزا جهت تشخیص ویروس PVX، جمع آوري و درون بسته بنديهاي مناسب قرار داده شدند. مواد درون هر کیت به نحوي انتخاب شد که بوسیله هر یک از آنها بتوان 100 نمونه گیاهی را از نظر آلودگی به ویروس PVX مورد آزمون قرار داد.
نتایج:
جدایه PVX-H8 فقط با آنتیبادي اختصاصی PVX واکنش مثبت داشته ولی با هیچکدام از آنتیباديهاي اختصاصی سایر ویروسها واکنش مثبتی نداشت. این نتایج و نتایج حاصل از بررسی دامنه میزبانی، تایید کننده ماهیت جدایه PVX-H8 از نظر مطابقت با خصوصیات توصیف شده در مورد ویروس ایکس سیبزمینی بود. همچنین این نتایج نشان داد که جدایه PVX-H8 با سایر ویروسهاي بیمارگر در سیبزمینی اختلاط ندارد - جدول یک - .منحنی جذب نوري سوسپانسیون ویروس خالص در طول موجهاي 200 تا 300 نانومتر در شکل - 1 - مشاهده میشود. میزان ویروس خالص شده برابر 9/7 میلی گرم به ازاي هر صد گرم بافت برگ توتون آلوده بود. نسبتA260/A280 در حدود 1/4 تا 1/45 بود که با مقادیر گزارش شده در مورد این ویروس مطابقت دارد 1 - و . - 2 آموده ویروس خالص شده به حجم هاي 50 میکرو لیتري تقسیم شده و در دماي -20 درجه سانتیگراد براي ادامه کار نگه داري گردید.
نتایج اولیه حاصله از آزمون الایزا، نشان داد که دقت و حساسیت تشخیصی IgG تهیه شده در این پروژه، تا رقت هاي 1:500 و1:1000، با نوع مشابه خارجی برابري می نماید، در حالیکه در رقت 1:2000 ، مقادیر جذب نوري چاهک ها در مورد IgG ساخت شرکت خارجی، اندکی بیش از مقادیر متناظر در مورد IgG تهیه شده در این بررسی بود. با استفاده از روغن ادجوانت کامل فروند - Fround’s complete adjuvant - در مراحل تزریق، غلظت آنتیبادي حاصله افزایش یافته و نتایج حاصل از رقت 1:2000 آنتیبادي تولیدي در این تحقیق با نتایج رقت مشابه از آنتیبادي خارجی تفاوت معنیداري نداشت - جدول . - 3جدول سه: نتایج آزمون الایزا با استفاده از آنتی بادي تولیدي در این پروژه و آنتی بادي تهیه شده از شرکت خارجی. از عصاره برگ سیبزمینی رقم مارفونا سه هفته پس از مایهزنی با جدایه PVX-H8 در بافر فسفات 0/1 مولار - به نسبت 1 گرم بافت در 10 میلیلیتر بافر - استفاده شد.
