بخشی از مقاله
*** این فایل شامل تعدادی فرمول می باشد و در سایت قابل نمایش نیست ***
طراحي و تهيه کيت الا يزا اويديتي و مقايسه آن با روش الايزا در تشخيص توکسوپلسما گوندي بر روي نمونه هاي سرمي و مايع آمنيوتيک
چکيده
زمينه و اهداف : يکي از راههاي انتقال بيماري توکسوپلاسموزيس مادرزادي از طريق جفت به جنين ميباشد که تشخيص اين بيماري را در اين مرحله بسيار حائز اهميت مينمايد. توکسوپلاسموزيس مادرزادي چنانچه در سه ماهه اول بارداري رخ دهد به سقط جنين و اختلالات اعصاب مرکزي و چشمي منجر ميشود. لذا روشهاي تشخيصي دقيق در بررسي زنان مبتلا به عفونت توکسوپلاسموزيس حائز اهميت ميباشد که شامل روشهاي سرولوژي مانند الايزا والايزا اويديتي هستند.
مواد و روشها: در اين مورد از طراحي يک روش دستي الايزا اويديتي و بررسي و مقايسه نتايج آن با روش تجاري الايزا اويديتي رايج در آزمايشگاه هاي مختلف استفاده گرديده است . نمونه هاي سرمي و مايع آمنيوتيک از ٤٨ مادر بارداري که سابقه سقط جنين داشته اند در بيمارستان شريعتي تهران جمع آوري گرديد. براي مقايسه ، يک روش الايزاي اويديتي به طريق دستي نيز در دانشگاه تربيت مدرس طراحي گرديد. بررسي هاي آماري با نرم افزار Spss
نسخه ١٩ صورت گرفت .
يافته ها: نتايج روش الايزا نشان داد که در بيشتر مادران مورد مطالعه ، عفونت توکسوپلاسموزيس اخيرا رخ داده است .
نتيجهگيري: تفسير اين مقايسه حاکي از آن است که در تشخيص انگل توکسوپلاسما گوندي روش الايزا تنها آنتي بادي IgM را به خوبي اندازه گيري ميکند اما در روش الايزا اويديتي هردو آنتي بادي IgM وIgG به درستي قابل اندازه گيري است ، همچنين روش الايزا اويديتي زمان ابتلاي مادر به انگل توکسوپلاسما گوندي را تعيين ميکند.
کليدواژه ها: توکسوپلاسما گوندي، الايزا، الايزا اويديتي، مايع آمنيوتيک ، آنتي بادي IgG
مقدمه
يکي از روشهاي تشخيصي توکسوپلاسموزيس مادرزادي روش الايزا است که با نتايج مثبت کاذبي همـراه مـيباشـد. امـروزه روشـي جديدتر براي تشخيص اين بيماري در مـادران اسـتفاده مـيشـود کـه روش الايزا اويديتي نام دارد که هم آنتي بادي عليه انگل و هـم زمـان ابتلاء به عفونت را مشخص ميکند (٢,١). تـاکنون طيـف وسـيعي از گونه هاي توکسوپلاسما جدا شده است ولي به نظر ميرسد فقـط يـک گونه از آن قادر به بيماري زايي در انسان باشد. شکل غير جنسي و بـا تکثير فعال انگل در انسان يک انگل داخـل سـلولي اجبـاري، گلابـي شکل و به اندازه تقريبي ٣ تا ٦ ميکرون اسـت . ايـن انگـل کـه تـاکي زوئيت ناميده ميشود داراي يک غشاي سلولي – هسته و اندامک هـاي متعددي است . اجتماع تاکي زوئيت ها ميتواند سلول را کـاملا اشـغال کرده و با ايجاد يک غشاء در اطراف خود تبديل به يک کيست گـردد (٢,١). در مرحله کيستي انگل برادي زوئيت ناميده شـده و بـه لحـاظ متابوليسم آرام است . شواهد موجود نشان ميدهند که از لحـاظ آنتـي ژني تاکي زوئيت و برادي زوئيت با يکديگر متفاوت هستند. کيست ها
محتوي ٥٠ تا چندين هزار برادي زوئيت بوده و قطر آنها از ١٠ تا ١٠٠ ميکرون متفاوت است . در سلولهاي اپي تليـال گربـه اشـکال متنـوعي وجود دارد که سرانجام تبديل به گامتوسيت هاي نر و ماده مـيشـوند.
ماکروگامتها بارور رشد کرده و تبديل به ااسيسـتهاي گـرد مـيگردنـد.
ااسيستها سلولهاي اپي تليال گربه را پاره کرده و به هنگام دفع با مدفوع گربه ١٠ الي ١٣ ميکرون قطر دارند (١,٢). ديواره ااسيسـتها دوجـداره بوده و محتوي مواد تقسيم نشده است ولي اين مواد پس از چنـد روز از دفع ااسيست تبديل به ٢ اسپوروسيست ميشوند. هر اسپوروسيست به نوبه خود داراي ٤ اسپوروزئيت است (٥-٣). بـه طـور کلـي روش رايج امروزي براي تشـخيص توکسوپلاسـموزيس مـادرزادي شـامل روشهاي الايزا و الايزا اويديتي است که در روش الايزا، آنتي باديهاي IgG و IgM و در روش الايــزا اويــديتي زمــان ابــتلاء بــه انگــل توکسوپلاسما گوندي مشخص ميگردد (٨-٦).
مواد و روشها
يکي از ابزارهاي الايزاي اويديتي کشف مراحل حاد يا مزمن بيماريهاي عفوني مانند توکسوپلاسما گوندي است . بعضي مواقع به دلايل مختلف ارزيابي صرفا IgM براي مراحل حاد توکسوپلاسما گوندي مفيد نيست که از آن جمله ميتوان به پاسخ هاي طولاني مدت IgM و تاخير در توليد اين آنتي بادي و يا پاسخ هاي غيراختصاصي پلي کلونال IgM عليه فاکتورهاي گوناگون نام برد. در سالهاي اخير کشف روش الايزاي اويديتي در بررسي عفونت هاي اخير با انگل توکسوپلاسما گوندي راهکاري مناسب براي اين موضوع است که فقط به ارزيابي آنتي بادي از کلاس IgG ميپردازد. در اوايل عفونت مقدار آنتي بادي IgG در اتصال به آنتي ژن در حالت LOW AVIDITY قرار دارد و با ادامه عفونت تمايل آنتي بادي مذکور براي آنتي ژن انگل توکسوپلاسما گوندي افزايش يافته و در حالت HIGH AVIDITY قرار ميگيرد که نشانه عفونت طولاني مدت ميباشد. محتويات کيت مورد آزمايش بايد در دماي ٢ تا ٨ درجه سانتيگراد ذخيره سازي شوند و نبايد در حالت فريز قرار گيرند. بايد حتما به تاريخ انقضاي کيت مورد آزمايش دقت شود. تمامي محتويات کيت مورد آزمايش بايستي ٣٠ دقيقه قبل از آزمايش در دماي آزمايشگاه يعني ١٨ تا ٢٥ درجه سانتيگراد قرار گيرند. در اين کيت کليه کنترل ها، بافر فسفات و بافر اوره آماده براي استفاده ميباشند و قبل از مصرف بايستي به آرامي تکان داده شوند. کليه کنترل ها و کاليبراتورهاي اين روش از نظر تستهاي HIV و HBS مورد آزمايش قرار گرفته اند و از اين از نظر مصون هستند ولي کليه نکات ايمني در هنگام کار کردن با اين کيت ميبايست لحاظ شود. نمونه مورد استفاده در اين آزمايش سرم خون انساني و يا پلاسماي تهيه شده با مواد ضد انعقاد مانند EDTA,HEPARIN,CITRATE بدست آمده است .
کليه نمونه ها در اين روش فقط تا مدت زمان ١٤ روز قابل استفاده است و نمونه هاي رقيق شده در همان روز بايستي مورد آزمايش قرار گيرند. کيت مورد استفاده در اين آزمايش داراي ماده سمي سديم آزيد است که از تماس مستقيم با پوست جدا بايد خود داري شود. در اين روش از کليه نمونه هايي که داراي مقادير کافي آنتي بادي IgG عليه انگل توکسوپلاسما گوندي است ميتوان استفاده کرد که از آن جمله ميتوان مايع آمنيوتيک را نام برد که با روش آمنيوسنتز از مادران باردار داراي سقط جنين مکرر که احتمال وجود آنتي بادي IgG عليه انگل توکسوپلاسما گوندي را دارند بدست ميآيد. کليه نمونه ها بايستي به ميزان ١: ١٠١ رقيق شوند که شامل ١٠ لاندا سرم يا مايع آمنيوتيک و ١ سي سي رقيق کننده تست ميباشد (بافر رقيق کننده ) و بايد کاملا مخلوط گردند.
جهت بررسي توکسوپلاسموزيس از کيت الايزا اويديتي طراحـي و ساخته شده در آزمايشگاه انگـل شناسـي و کيـت آمـاده و تجـاري الايزا اويديتي که بر اساس روشـهاي آنزيماتيـک عمـل مـيکننـد و براي روش الايزا از کيت آمـاده داخلـي اسـتفاده گرديـد. تعـداد ٤٨ نمونه سرم و مايع آمنيوتيـک از زنـان ٢٠ تـا ٤٥ سـاله اي کـه داراي آنتي بادي عليه انگل توکسوپلاسـما مـيباشـند تهيـه شـد کـه ايـن نمونـه هـا اکثـرا از بيمارسـتان شـريعتي تهـران و تعـدادي از مرکـز
ناباروري ابن سينا و آزمايشـگاه پـاتوبيولوژي مرکـزي تهـران جمـع آوري شدند. روشهاي آزمايش شامل روش الايزا و الايـزا اويـديتي بود. کيت آماده مورد استفاده در اين آزمايشات کيت يوروايميون نـام دارد که بر اساس روشهاي آنزيماتيک عمـل مـيکنـد. بـراي جمـع آوري نمونه ها ابتدا مادراني که داراي که داراي سابقه سقط جنـين و داراي تيترهاي آنتي بادي عليه انگل توکسوپلاسـما گونـدي بودنـد شناسايي شده و نمونه مـايع آمنيوتيـک آنهـا در بيمارسـتان توسـط متخصص زنان و زايمان جمع آوري و سپس همزمان نمونـه خـون آنها تهيه شد و هردوي اين نمونه هـا بـا ثبـت تـاريخ و مشخصـات بيمار از لحاظ سن ، تعداد سقط هاي جنين ، سابقه تمـاس بـا گربـه و حتي المقدور منطقه سکونت آنهـا بـه صـورت پرسشـنامه اي سـاده تهيه شد و نمونه ها سرم و مايع آمنيوتيک آنها بلافاصـله در يخچـال
٢٠ درجه سانتيگراد، فريز گرديد. کليه نمونـه هـا بايسـتي در عـرض حداکثر يک هفته مورد آزمايش قرار ميگرفتند. بررسي هاي آمـاري با نرم افزار spss نسخه ١٩ صورت گرفت .
مايع صفاق موش هاي سفيد کوچک آزمايشگاهي که ٧ روز قبل با تاکي زوئيت هاي انگل توکسوپلاسما گوندي (١٠٦تاکي زوئيت در هر ميليليتر) به روش تلقيح داخل صفاقي آلوده شده بودند، آسپيره گرديد و با دور g١٠٠٠ به مدت ١٥ دقيقه سانتريفيوژ و سپس مايع رويي به عنوان ترکيب آنتي ژن هاي دفعي ترشحي استخراج گرديد. براي اين عمل نمک سولفات آمونيوم به تدريج به ظرف حاوي مايع صفاق موش اضافه گرديد و يک شب در يخچال و بعد از آن به مدت ٣٠ دقيقه در دور g١٠٠٠ سانتريفيوژ گرديد. سپس مايع رويي خارج و رسوب در مقابل بافر تريس
٠.٠٥مولار دياليز گرديد. سپس کيسه دياليز را در مقابل جريان شديد هوا قرار داده تا تغليظ صورت گيرد و ميزان پروتئين آن با روش برادفورد تعيين گرديد. آنگاه در ويال هاي درپيچ دار تقسيم و در دماي ٢٠- درجه سانتي گراد و در حضور آنتي بيوتيک تا زمان استفاده نگه داري گرديد. البته بهتر است براي تلقيح از موشهاي BALB.C استفاده کرد، زيرا تاکي زوئيت انگل توکسوپلاسما گوندي در اين نوع موش راحت تر و سريعتر بالا ميآيد (١٣-٩).
در روش پوشش دهي آنتي ژن هاي انگل از بافر PBS به عنوان بافر پوشش دهنده و از بافر PBS و توئين ٨٠ به همراه سرم آلبومين گاوي به عنوان بافر مسدود کننده استفاده گرديد. براي تعيين غلظت پروتئين از روش برادفورد با استفاده از رنگ کوماسي بريلينت بلو (کلريمتري) استفاده گرديد و با توجه به منحني استاندارد موجود در کيت مورد آزمايش غلظت پروتئين هاي موجود در سوسپانسيون تهيه شده از صفاق موش ، تعيين گرديد.
براي عمل پوشش دهي نياز به انکوباسيون ٢٤ ساعته در دماي ٣٧ درجه سانتيگراد و براي عمل مسدود کردن نياز به انکوباسيون ١ ساعته در دماي ٤ درجه سانتيگراد بود. براي تعيين نقطه برش (cut off) کيت تهيه شده از بافرهاي NAKCN و بافر Pnpp (پارانيتروفنيل فسفات ) در دي اتانول آمين استفاده گرديد. تست استاندارد مورد استفاده در اين آزمايشات روش الايزاي ساده بود.
محاسبه نتـايج حاصـل از روش نيمـه کمـي الايـزاي اويـديتي
(رابطه ١):
در صورتيکه نسبت فوق کمتر از ٠.٨ باشد نتيجه منفي، اگر بين
٠.٨ تا ١.١ نتيجه در حد مرز و اگر نتيجه بالاتر از ١.١ باشد نتيجه الايزا اويديتي مثبت است .
محاسبه نتايج با روش کمي الايزا اويديتي (رابطه ٢):
عدد حاصله در عدد ١٠٠ ضرب ميشود که نتيجه نهايي به صورت درصد بيان ميشود و تحت عنوان RIA بيان ميگردد. اگر
RIA کمتر از ٤٠% باشد نشانه LOW AVIDITY ANTIBODY
است و اگر RIA بين ٤٠% تا ٦٠% باشد نشانه INTERMEDIATE AVIDITY، و اگر بالاتر از ٦٠% باشد نشانه HIGH AVIDITY ANTIBODY عليه انگل توکسوپلاسما گوندي است . روش نيمه کمي الايزا اويديتي فقط مثبت يا منفي بودن وجود آنتي بادي را بررسي ميکند و در اين آزمايش به علت اينکه نمونه هاي مورد آزمايش همگي تفکيک شده بودند و از لحاظ آنتي بادي IgG عليه توکسوپلاسما گوندي مثبت بودند از لحاظ تست نيمه کمي الايزا اويديتي نيز مثبت ميباشند، ولي گاهي ممکن است آزمايش الايزاي ساده يک بيمار از لحاظ آنتي بادي IgG عليه توکسوپلاسما مثبت باشد اما نتيجه اويديتي وي منفي گردد که به علت نتايج کاذب و مداخله کننده عليه بيماريهاي ديگر مانند آرتريت روماتوئيد، لوپوس سيستميک و برخي عفونت هاي ديگر باشد. به عبارت ديگر نتيجه مثبت الايزا اويديتي نيمه کمي يک مادر باردار قطعا وجود آنتي بادي IgG عليه انگل توکسوپلاسما گوندي را تاييد ميکند. در کليه مادران مورد بررسي تست الايزاي ساده از نظر IgG مثبت بوده و ميانگين الايزاي اويديتي نيمه کمي آنها نيز نشان دهنده وجود آنتي بادي IgG حقيقي توکسوپلاسمايي در سرم آنها ميباشد. در روش الايزا اويديتي کمي علاوه بر مثبت بودن آزمايش از نظر عفونت توکسوپلاسموزيس ، زمان ابتلاء مادر هم مشخص ميگردد.
همانگونه که در جدول ١ و ٢ مشاهده ميگـردد ميـانگين تيتـر اويديتي در هر دو حالت کمي و نيمه کمي با افـزايش تعـداد سـقط جنين در مادران باردار افزايش مييابد. بـه طـور مثـال در جـدول ١ ميانگين تيتر اويديتي نيمه کمي مادران با سـابقه ١ بـار سـقط جنـين ١.٨٧ و همين ميانگين در مادران بـا سـابقه ٤ بـار سـقط جنـين بـه ٢.٧٨ ميرسد يا به طور مثال در جـدول ٢ ميـانگين تيتـر اويـديتي کمي مادران با سابقه ١ بار سقط جنين ٤٥% است در حاليکه همـين ميانگين در مادران با سابقه ٤ بار سقط جنين بـه ٦٧% مـيرسـد کـه نشان ميدهد تيتـر IgG آنتـي بـادي عليـه انگـل توکسوپلاسـما بـا افــزايش تعــداد ســقط جنــين ، ســير صــعودي دارد. تمــامي ايــن
ميانگين هاي تيترهاي اويـديتي در زمـاني کـه کيـت مـورد نظـر بـه صورت دستي در آزمايشگاه طراحي ميگـردد، افـزايش محسوسـي را نشان ميدهد که ميتواند به علت تـازگي آنتـي ژن انگلـي تهيـه شــده در آزمايشــگاه يــا بــه علــت ســوش RH اســتاندارد انگــل توکسوپلاسما باشد. به طور مثال ميانگين تيتر اويديتي نيمه کمـي در مادران با سابقه ١ بار سقط جنين بـا کيـت خـارجي ١.٨٧ اسـت در صـورتيکه
