بخشی از مقاله
استخراج و خالص سازی جزئی سم نماتوسیت عروس دریایی Crambionella
نسرین هداوند 1*، یداالله نیک پور قنواتی 1 ، زهرا رمضانی 2 ، محمد آبرومند 3 ، محمدباقر نبوی 4
(1 گروه شیمی دریا، دانشکده علوم دریایی و اقیانوسی، دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر، خوزستان، ایران (2 مرکز تحقیقات داروهای دریایی، دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور اهواز، خوزستان، ایران (3 گروه بیوشیمی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور اهواز، خوزستان، ایران
(4 گروه بیولوژی دریا ، دانشکده علوم دریایی و اقیانوسی، دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر، خوزستان، ایران
chemist6424@yahoo.com*
چکیده
سم عروس دریایی با ساختار پروتئینی در مصارف دارویی و تولید پادزهر کاربرد دارد. با توجه به اینکه مضرات استفاده از انواع فراورده های شیمیایی به روشنی به اثبات رسیده است، امروزه استخراج از منابع طبیعی بسیار مورد توجه قرار دارد. در این تحقیق بعد از جمع آوری عروس دریایی Crambionella از مصب اروندرود در ورودی خلیج فارس، نماتوسیت ها از بافت جدا و سم از آنها استخراج شد. بعد از تزریق I.V و I.P سم خام استخراج شده به موش های نر سفید رنگ 20 تا 30 گرمی، کشندگی آن تایید شد. سم خام به روش ژل کروماتوگرافی سفادکسG-200 خالص سازی و به طور کلی سه پیک فعال مشاهده شد که فرکشن های پیک سوم فعالیت کشندگی نشان داد. وزن مولکولی این گروه از پروتئین ها توسط الکتروفورز SDS page اندازهگیری شد. در نتیجه الکتروفورز پیک سوم، چهار باند با وزن های مولکولی 90 تا 225 کیلو دالتون مشاهده شد. در این پژوهش تلاش بر این است که گامی در جهت استخراج و شناسایی ویژگی های این گروه از منابع دریایی برداشته شود.
واژه های کلیدی: الکتروفورز، خلیج فارس، سفادکسG-200، سم نماتوسیت، عروس دریایی.
مقدمه
عروس دریایی گونهای از بیمهرگان است که در شاخه نیداریا و رده سیفوزوآ طبقه بندی می شود. نیداریا یکی از شاخه های گوناگون متازوا است که شامل بیش از 10000 گونه می شود 5)، .( 26 این موجودات دارای ساختار زیبایی هستند، به همین جهت عروس دریایی نامیده میشوند. قطر بدن در مرکز چتر و در حاشیه لبهها، نازک است و تعدادی تنتاکول در لبه داردکه حاوی نماتوسیتهای خطرناکی است و نیش انواعی از آنها موجب مرگ انسان میشود. عروس دریایی می تواند برای شکار غذا و یا دفاع از خود در مقابل شکارچیان ، سم هایی تولید کند. گزش تصادفی توسط عروس دریایی سمی می تواند به آسیب های شدید موضعی و سیستمیک و در برخی موارد به مرگ منجر شود .(22) نروتوکسین های نماتو سیت می تواند باعث فلج شدن یا مرگ طعمه های کوچکی شود که غذای عروس دریایی را تشکیل می دهند. بیش از 30 گونه مورفولوژیکی از نماتوسیت ها در گونه های مختلف نیداریا شناسایی شده است .(16) علائم ناشی از گزش عروس دریایی بوسیله مخلوط پیچیده بیولوژیکی فعال که زهر نماتوسیت را تشکیل می دهند بوجود می آید. بنابراین شناسایی زهر عروس دریایی اولین گام در ارتقای درک ما از چگونگی عملکرد آن است، که به ما اجازه می دهد بتوانیم درمان موثری در مقابل گزش عروس دریایی انجام دهیم .(14) در بررسی نوعی سم عروس دریایی بر روی موش و خوکچه هندی علائمی مانند آنچه در اثر گزش انسان توسط این گونه رخ می دهد، مشاهده شد .(19) در مطالعات سم شناسی و بیولوژیکی زهر عروس دریایی توسط محققان در مورد فعالیت های همولیتیک 18) )، حشره کشی (24)، قلبی عروقی (17)، آنتی اکسیدانی (25)، آنزیمی (9 ) و مرگ سلولی 9)،(3 گزارش شده است .(20) بنابراین گونه ها و سم آن ها برای تحقیقات دارویی مورد توجه هستند. تحقیق بر روی فعالیت های زیستی سم عروس دریایی می تواند برای جلوگیری و
739
اولین همایش ملی توسعه پایدار دریا محور
دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر، 8-9 بهمن 1393
یا کاهش علائم ناشی از آلوده شدن به همان سم و نیز برای سلامت انسان مفید باشد .(12) تنوع در ترکیب سم برای بسیاری از گونه های عروس دریایی بنابر دلایلی مثل پراکندگی جغرافیایی، خویشاوندی، مسائل ژنتیکی بین و درون گونه ای و حتی تنوع فردی ایجاد شده است 4)، 13، 21 ،.(23
سم عروس دریایی با ساختار پروتئینی در مصارف دارویی کاربرد فراوان دارد و با توجه به اینکه عروس دریایی در آبهای خلیج فارس و دریای عمان در سطح وسیعی زندگی میکند و تنوع زیادی در گونه های آن وجود دارد، امکان استخراج و بهرهبرداری از سم آن با توجه به امکانات در منطقه وجود دارد . با توجه به اینکه امروزه مضرات استفاده از انواع فراورده های شیمیایی به روشنی به اثبات رسیده است، استخراج منابع طبیعی به خصوص منابع طبیعی دریایی بسیار مورد توجه است، در این پژوهش تلاش بر آن است که گامی در جهت استخراج و شناسایی ویژگی های گروهی از این ترکیبات برداشته شود.
مواد و روش ها
مواد مورد نیاز از شرکت مرک و سیگما تهیه شد .
استخراج نماتوسیت ها: نمونه های عروس دریایی از مصب رودخانه اروند در آبان ماه 1392 جمع آوری شدند. بلافاصله پس از جدا کردن بازوهای شکمی از چتر، بازوها به مدت 4 روز در یک مخزن شیشه ای در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار داده شدند . طی این مدت محتویات درون مخزن چندین بار به شدت هم زده شدند. پس از آن محتویات مخزن از یک صافی عبورداده شد و پس از انجام تست میکروسکوپی و اطمینان از وجود نماتوسیت در محلول (شکل (1؛ مایع بدست آمده توسط فریز درایر به پودر خشکی که حاوی نماتوسیت های عروس دریایی بود تبدیل و در دمای -70 درجه سانتیگراد نگهداری شد.
آماده سازی سم: مقدار معینی از پودر حاوی نماتوسیت ها با نسبت 1:6 با آب دوبار تقطیر سرد مخلوط و جهت بررسی تست میکروسکوپی انجام شد(شکل .(1 بوسیله دستگاه سونیکاتور مدل UP50H در 3 دوره 20 ثانیه ای با فاصله زمانی کمتر از 1 دقیقه و روی یخ در 3 میلی آمپر دیواره سلولی نماتوسیت ها تخریب و سم از درون آن خارج گردید. سپس بوسیله سانتریفیوژ یخچال دار مدل MICRO 220R در 16000 دور در دمای 4 درجه سانتیگراد محلول شفاف شد. محلول حاوی سم خام را در میکروتیوب های 0/5 سی سی ذخیره و در -20 درجه سانتیگراد نگهداری شد.
اندازهگیری غلظت سم خام : مقدار 0/5 میلی لیتر از سم خام با بافر فسفات 0/05 مولار تا 400 برابر رقیق و توسط دستگاه اسپکتروفتومتر Unic آمریکا در ناحیه 280 nm جذب محلول را اندازهگیری و غلظت پروتئین محاسبه شد.
741
اولین همایش ملی توسعه پایدار دریا محور
دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر، 8-9 بهمن 1393
کشندگی سم: برای اطمینان از صحت استخراج سم و کشندگی آن مقدارمعینی از سم خام به 6 موش سوری نر سفید رنگ 20 تا 30 گرمی، تزریق شد. 4 موش به روش تزریق صفاقی و 2 موش به روش تزریق وریدی مورد آزمایش قرار گرفتند که به هر موش مقدار 0/5 میلی لیتر از سم خام رقیق شده با نسبت برابر از سرم فیزیولوژی تزریق شد. در نتیجه 3 موش با تزریق صفاقی و یک مورد با تزریق وریدی مردند .
کروماتوگرافی سفادکس:G-200 برای خالص سازی جزئی سم عروس دریایی، مقدار 1 میلی لیتر از سم خام از ستونی با قطر 1/8 و طول 35 سانتیمتر از ژل سفادکسG-200 با جریانی از بافر فسفات 0/05 مولار با سرعت 6 میلی لیتر بر ساعت عبور داده شد. در نهایت 50 فرکشن سه میلی لیتری جمع آوری و بلافاصله جذب آنها در ناحیه 280 nm قرائت و غلظت پروتئین اندازهگیری شد.
تعین جرم مولکولی: الکتروفورز SDS page یک بعدی ژل پلی اکریل آمید به روش Laemmli, 1970 برای تعیین جرم مولکولی سم خام و فرکشن کشنده سم انجام شد. ژل شامل دو بخش ژل متراکم کننده % 4 حاوی محلول آکریل آمید%30، بافر ژل متراکم کننده با pH= 6/8، آب مقطر، APS و TEME و ژل جداکننده %10 حاوی محلول آکریل آمید%30، بافر ژل جدا کننده با 8/8 pH=، آب مقطر، APS و TEMED بود، بعد از پلیمریزه شدن ژل و نمونه گذاری، سیستم تحت ولتاژ ثابت 150 ولت قرار گرفت و در نهایت رنگ آمیزی نیترات نقره روی ژل انجام شد.
نتیجه گیری
غلظت نسبی سم خام توسط فرمول برابر 67 mg /ml تخمین زده شد
.(7) منحنی جذب فرکشن های کروماتوگرافی در 280 نانومتر رسم و غلظت نسبی پروتئین در هر فرکشن محاسبه شد (نمودار .(1 دراین نمودار 3 پیک مشاهده شد که فرکشن های مربوط به آن ها توسط فریزدرایر تغلیظ و به موشهای سوری 30 گرمی نر سفید تزریق شد که فرکشن شماره 22 از پیک (C) باعث مرگ موش و سایر فرکشن های این پیک نیز باعث بروز علائم حادی از جمله فلج موضعی در موش ها شدند. غلظت پروتئین ها بر حسب mg /ml پروتئین بر اساس جذب در 280 nm برای فرکشن ای مختلف محاسبه شد .(7)
پس از انجام کروماتوگرافی سم خام و فرکشن های 14 تا 29، تحت سیستم Biorad، Native الکتروفورز شدند و سپس الکتروفورز SDS Page روی آن ها انجام شد (شکل2، a و.(b در الکتروفورز Native برای همه فرکشن های مورد بررسی تنها یک پیک و در یک ناحیه دیده شد درحالی که برای سم خام 7 باند مشاهده شد.
در الکتروفورز SDS Page برای مجموع فرکشن های پیک C، 4 باند در محدوده وزن مولکولی 90، 120، 125 و 225 کیلو دالتون ظاهر شد.
در این مطالعه جهت استخراج و نگهداری نماتوسیت های حاوی سم عروس دریایی از روش Bloom et al, 1998 استفاده شد. این روش به عنوان یک روش مقدماتی مؤثر و پاک در آماده سازی نمونه سم فعال نماتوسیت ها برای آنالیز آزمایشگاهی استفاده می شود. نمونه آماده شده با این روش به راحتی در مسافت های طولانی قابل انتقال است، همچنین سم در -70℃ برای مدت طولانی پایدار می ماند. سم بعد از 3 بار فریز -ذوب شدن تخریب می شود.
